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O que é absorbância?
Em geral, a absorção é um processo de interação da luz com a matéria. Quando a luz atinge algo que absorve parte da luz, falamos de absorção. Obviamente, a luz absorvida não é perdida; ela é transformada em calor ou energia química à medida que a molécula absorvente é excitada. A absorção é um processo físico com o qual nos deparamos todos os dias quando vemos as cores: A luz branca, como a luz solar, contém todas as cores da luz visível. Quando ela incide sobre a grama verde, a grama absorve todas as cores, menos a verde. A luz verde é reemitida e é isso que dá à grama a sua cor.
Fundamentos teóricos das medições de absorbância
Caminho de detecção em cubetas e microplacas
Tradicionalmente, as medições de absorbância eram realizadas em uma cubeta: Uma solução com um analito de características de absorbância conhecidas é colocada em uma cubeta. Em seguida, um leitor de absorbância determina a absorbância enviando luz com intensidade conhecida através da amostra e detectando a intensidade atrás da amostra. A luz que não passou pelo detector foi absorvida ou espalhada. A parte dispersa é determinada separadamente por meio da medição de espaços em branco apropriados e é subtraída desse valor para obter a absorbância pura da substância de interesse.
O resultado das medições de absorbância - transmissão, absorbância e densidade óptica
A porção da luz que consegue passar pela amostra também é chamada de transmissão e é dada principalmente como porcentagem (Fig. 2). Quanto mais analito for encontrado na solução, mais luz será absorvida por ele e menor será a transmissão. A absorbância, entretanto, é a parte da luz que foi absorvida pelo analito. Ela é o valor absoluto do logaritmo (elevado à potência de 10) da transmissão1. Aqui estão as equações matemáticas e alguns números para explicar o que é descrito por transmissão e absorbância:
Transmissão: T =Iout /Iin
Absorbância: A =-log10T
Tabela 1: Exemplos de valores de transmissão e de absorbância
| Transmissão | Absorbância |
| 0,1 (ou 10%) | 1 OD |
| 0,01 (ou 1%) | 2 OD |
| 0,001 (ou 0,1%) | 3 DO |
Absorbância em química e ciências da vida - quantificar uma substância em solução
Após realizar uma medição de absorbância, o resultado é um valor dado em transmissão ou densidade óptica. No entanto, se o objetivo da medição for a quantificação de uma substância em solução, a questão óbvia é como converter o sinal em um valor de concentração. Em geral, há duas maneiras: empregando a lei de Beer-Lambert ou medindo uma curva padrão em paralelo a amostras de concentrações desconhecidas.
Lei de Beer-Lambert
A lei de Beer-Lambert descreve a relação entre a absorbância, o comprimento do caminho e a concentração de uma substância absorvente:
A=c*d*ε
Alterado para c: c=A/(d*ε)
Lei de Beer-Lambert com A - Absorbância, c - concentração, d - comprimento do caminho, ε - coeficiente de extinção.
Ela diz que a absorbância é linear à concentração multiplicada pelo comprimento do caminho e pelo coeficiente de extinção2. O comprimento do caminho refere-se ao comprimento da amostra que a luz tem de atravessar. Por exemplo, em uma cubeta, o caminho é padronizado para 1 cm. O coeficiente de extinção é uma constante específica para uma substância absorvente e um comprimento de onda específico, normalmente o máximo de absorção da substância. Ele fornece informações sobre a intensidade com que a substância específica absorve a luz no comprimento de onda específico. Como exemplo, o coeficiente de extinção de massa da albumina de soro bovino (BSA) é 0,67 µl*cm-1*µg-1. Assim, uma solução de 1 µg/µl de BSA com um comprimento de caminho de 1 cm tem uma absorbância de 0,67 OD.
A lei de Beer-Lambert é muito útil, pois permite a quantificação de substâncias absorventes sem a necessidade de adicionar outros reagentes. Entretanto, ela é limitada, conforme descrito abaixo.
A lei de Beer-Lambert só pode ser usada se
- O analito absorve a luz em um comprimento de onda específico
- O comprimento do caminho for conhecido
- O coeficiente de extinção do analito for conhecido
- A absorbância dos reagentes do tampão não se sobrepuser à absorbância do analito
Uso de uma curva padrão
Se algum desses critérios não se aplicar, existe a possibilidade de medir indiretamente os analitos e/ou usar uma curva padrão. Por exemplo, os ensaios de quantificação colorimétrica de proteínas, como o ensaio de Bradford, dependem de uma substância que aumenta a absorbância na presença de proteínas. O aumento é medido em uma curva padrão com concentrações conhecidas de proteínas, bem como em amostras, de modo que a concentração delas possa ser calculada.
Como a absorbância é detectada?
Fonte de luz
É autoexplicativo: a medição da transmissão/absorção de luz requer primeiramente luz. Diferentes fontes de luz podem ser usadas para medições de absorbância. Elas diferem na faixa espectral que cobrem, em sua intensidade e na estabilidade da luz que emitem.
As lâmpadas halógenas de tungstênio cobrem a faixa de 360 nm a mais de 1000 nm e são usadas com frequência devido ao seu custo-benefício. As lâmpadas de xenônio, no entanto, abrangem a região espectral de 220 nm a 1000 nm e cobrem a faixa UV do espectro. Isso possibilita a detecção e a quantificação de ácidos nucleicos (260 nm) e proteínas (280 nm). Os leitores de microplacas de absorbância BMG LABTECH são equipados com uma lâmpada de xenônio para medições de absorbância e, portanto, oferecem flexibilidade máxima para medir qualquer comprimento de onda entre 220 e 1000 nm, ou todo o espectro de comprimentos de onda.
Amostra
Os líquidos de interesse precisam ser transferidos para uma cubeta ou para uma microplaca a fim de medir sua absorbância. O material da cubeta e da microplaca é sempre transparente para garantir a máxima transmissão de luz, já que a absorbância da solução, e não do material, é de interesse do pesquisador. Ainda assim, vários materiais são comuns e diferem entre si. O poliestireno é usado com mais frequência e pode ser alterado para fornecer características de ligação específicas, seja para cultura de células ou aplicações ELISA. Entretanto, eles não são transmissivos na faixa de UV, o que exige o uso de placas especiais de copolímero de olefina cíclica para medir a absorbância abaixo de 400 nm.
Volume da amostra
Um segundo aspecto a ser considerado é o volume de amostra necessário para medições confiáveis de absorbância. As cubetas padrão requerem aproximadamente 4,5 ml, enquanto as cubetas de semimicrovolume permitem a redução do volume para 1,5 ml e as cubetas de microvolume se contentam com 70 µl. A medição em cubeta é horizontal: a luz é direcionada de um lado para a amostra e, no lado oposto, a luz transmitida é detectada. Portanto, a geometria das cubetas fornece um comprimento de caminho padronizado de 1 cm. Essa é uma das principais diferenças em relação às medições em microplacas, pois elas são executadas verticalmente (de cima para baixo ou de baixo para cima). Consequentemente, o comprimento do caminho também muda com o volume da amostra e requer o uso de volumes iguais para um experimento. Além disso, os efeitos do menisco desempenham uma função importante para o comprimento do caminho nas medições de absorbância em microplacas, conforme explicado em detalhes na Nota explicativa: Como lidar com o comprimento do caminho e o menisco em microplacas. As medições realizadas no meio de um poço de microplaca sofrem com um caminho muito mais curto na presença de um menisco forte em comparação com uma medição sem menisco. Isso é de importância específica ao aplicar Beer-Lambert ou ao ter meniscos altamente variáveis em um experimento. Em soluções aquosas, é possível corrigir as alterações de comprimento de caminho dependentes do menisco explorando a absorbância da água (correção de comprimento de caminho de pico de água).
Normalmente, são usadas placas padrão de 96 poços com volumes de amostra que variam entre 100 e 300 µl, o que se traduz em um comprimento de caminho aproximado de 2,9 a 7,4 mm. Pode ser necessário reduzir ainda mais o volume da amostra preciosa sem comprometer o comprimento do caminho. Para isso, podem ser usadas placas de meia área ou placas de densidade mais alta. Elas proporcionam uma área de poço menor, mas com a mesma altura das placas padrão de 96 poços e, portanto, proporcionam grandes comprimentos de percurso com volumes menores.
O branco apropriado
Para corrigir as medições de absorbância em relação à absorbância indesejada dos componentes do buffer, da placa e dos efeitos de dispersão da luz, um branco é medido em paralelo às amostras. O branco apropriado contém todos os componentes do ensaio, exceto o analito. Por outro lado, isso significa que um branco de PBS ou água geralmente é insuficiente.
Deve-se dar atenção especial às partículas encontradas nas amostras analisadas e nos brancos. As partículas dispersam a luz e aumentam o valor da absorbância medida, pois menos luz chega ao detector. À medida que as partículas se movem na solução, elas são detectadas quando bloqueiam o caminho da luz. Ao sair do caminho de detecção, elas não serão medidas. Esse fenômeno aumenta a variabilidade dos dados de absorbância. Se as partículas não puderem ser removidas das soluções medidas, recomenda-se cobrir uma área maior do poço da microplaca na medição de absorbância, um recurso que todos os dispositivos BMG LABTECH oferecem para medições de absorbância.
Detector de medições de absorbância
Depois que a luz transmitida passa pela amostra, ela precisa ser detectada. Dois tipos diferentes de detectores são normalmente usados em leitores de microplacas: um tubo fotomultiplicador (PMT) ou um espectrômetro CCD. Os sistemas baseados em PMT exigem a seleção do comprimento de onda antes da detecção. Isso é feito por filtros ópticos ou monocromadores que selecionam o comprimento de onda desejado antes que ele seja guiado até a amostra. A luz transmitida do comprimento de onda desejado chega então ao PMT. O PMT amplifica o sinal da luz transmitida e resulta em uma tensão indicativa de sua intensidade. Para fazer a varredura da absorbância em uma faixa de comprimentos de onda, os sistemas baseados em PMT usam um monocromador que seleciona o comprimento de onda desejado para cada ponto do espectro e os mede sequencialmente.
Essa é a principal diferença em relação ao segundo tipo de detectores de absorbância, o espectrômetro. Ele divide a luz transmitida em diferentes comprimentos de onda e esses são direcionados a um detector CCD, capturando a intensidade de todos os comprimentos de onda de uma só vez. Dessa forma, os espectros, bem como as medições de um ou poucos comprimentos de onda, podem ser adquiridos em um período de tempo semelhante. Por exemplo, os instrumentos da BMG LABTECH utilizamo espectrômetro UV/vis para medições de absorbância que capturam um espectro completo (220 a 1000 nm) em menos de um segundo.
