Espectrofotômetros | BMG LABTECH

Um Espectrofotômetro, (outro nome: leitor de microplacas de absorbância), é um equipamento capaz de detectar e quantificar os fótons de luz absorvidos/transmitidos por uma amostra líquida presente em uma microplaca, quando exposta à luz em um comprimento de onda específico.

Ao contrário da fluorescência e luminescência, a detecção de absorbância é uma medida absoluta quantificada em densidade óptica (OD). OD é definido como a relação logarítmica entre a intensidade da luz que atinge uma sonda e a intensidade da luz transmitida através dela. Alternativamente, a transmissão, a porção de luz que passa pela amostra, também pode ser usada.

Os espectrofotômetros, também chamados de leitores UV/Vis, são usados para diferentes aplicações em vários campos, como pesquisa acadêmica em ciências da vida, descoberta e triagem de medicamentos, laboratórios clínicos, biologia sintética e monitoramento da qualidade de alimentos ou água.

Comparado a um espectrofotômetro padrão que mede uma sonda por vez em uma cubeta, um leitor de microplacas pode medir o mesmo ensaio de absorbância com maior rendimento. Ele pode medir uma microplaca completa de 96 poços em segundos, ou placas de 384 ou 1536 poços em alguns minutos.

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O que é um Espectrofotômetro?

Um Espectrofotômetro é um instrumento bastante complexo, opticamente falando. Devido à natureza do sinal, esses leitores de microplacas requerem uma fonte de luz de excitação, óptica para a seleção dos comprimentos de onda de entrada, um detector e um canal de referência.

A amostra é iluminada por luz com uma intensidade específica. A intensidade total de luz à qual a sonda é exposta é avaliada por um canal de referência medido antecipadamente. O detector de luz está localizado no lado oposto da microplaca em relação à fonte de luz. Ele mede a parcela da intensidade total da luz que é transmitida através da sonda e em quais comprimentos de onda. A luz que não passa pelo detector é absorvida.

A quantidade medida de luz transmitida pode ser normalmente usada para calcular a concentração de uma molécula de interesse, uma vez que a quantidade de luz absorvida está relacionada à sua concentração (lei de Beer-Lambert). Alternativamente, uma curva padrão e poços de concentrações desconhecidas podem ser usados. Desta forma, ácidos nucléicos, proteínas e moléculas específicas via ELISA podem ser quantificados.

Os espectrofotômetros estão disponíveis como leitores independentes dedicados ou, como parte de leitores de microplacas multimodo, quando combinados com intensidade de fluorescência e/ou detecção de luminescência.

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O que considerar ao escolher um Espectrofotômetro?

Se você está procurando um novo Espectrofotômetro (monomodo ou multimodo), há alguns fatores a serem levados em consideração, pois o desempenho do instrumento pode afetar significativamente a qualidade de seus dados de pesquisa.

Seleção de comprimento de onda
A capacidade de selecionar comprimentos de onda é obrigatória para um espectrofotômetro e depende do tipo de detector usado.

O leitor de microplacas baseado em PMT requer uma ferramenta de seleção de comprimento de onda entre a fonte de luz e o poço. Filtros ópticos ou monocromadores selecionam o comprimento de onda desejado antes que a luz seja enviada para a sonda. Dessa forma, apenas a luz em um comprimento de onda desejado é transmitida, atinge o PMT e é quantificada.

Para escanear espectros ou uma faixa de comprimentos de onda, o leitor de microplacas baseado em PMT requer um monocromador. O monocromador seleciona os comprimentos de onda desejados e os mede sequencialmente mediante movimento mecânico. Para medições de vários comprimentos de onda discretos, são necessárias várias medições únicas com filtros diferentes ou uma varredura de monocromador.

O leitor de microplacas baseado em espectrômetro CCD não requer uma ferramenta de seleção de comprimento de onda. O espectrômetro separa os diferentes comprimentos de onda presentes na luz transmitida através da sonda conforme estes são direcionados para o detector CCD. Este modo captura a intensidade de todos os comprimentos de onda de uma só vez, ao contrário de um monocromador. Dessa forma, espectros, comprimentos de onda discretos únicos ou múltiplos podem ser adquiridos em um curto período de tempo, pois nenhuma varredura mecânica é necessária como nos monocromadores.

Se o seu ensaio ou aplicação precisar de aquisição espectral, os espectrômetros CCD são significativamente mais rápidos que os monocromadores, pois a varredura espectral mecânica não é necessária.

Formatos de microplacas compatíveis
Os instrumentos BMG LABTECH monomodo e multimodo são equipados com um espectrômetro UV/vis para medições de absorbância. Isso captura um espectro de faixa completa de 220 a 1000 nm em menos de um segundo/poço.

Agitação e incubação
Ao procurar um Espectrofotômetro, você deve considerar a natureza de sua pesquisa e do ensaio que deseja realizar. Geralmente, agitação e incubação são duas características importantes. A incubação é extremamente importante ao executar ensaios enzimáticos em temperaturas estáveis, por ex. 37° C. Múltiplas opções de agitação permitem uma mistura adequada. Para aplicações como ensaios de crescimento celular em bactérias ou leveduras (OD600), a agitação da placa é crucial para uma boa oxigenação e consequente rápida replicação celular.

Compatibilidade com cubetas
Tradicionalmente, as medições de absorbância eram realizadas em cubetas com comprimento de caminho normalizado de 1 cm. Em microplacas, o comprimento do caminho muda dependendo do volume e do formato da placa. Se forem medidas soluções aquosas, a medição da microplaca pode ser normalizada usando a correção do comprimento do caminho do pico da água. Se, apesar desta opção, para sua pesquisa você ainda precisar ocasionalmente medir em cubetas, certifique-se de que o leitor de microplacas escolhido tenha uma porta de cubeta integrada como o SPECTROstar Nano ou adaptadores de placa para medir cubetas horizontalmente como o LVis Plate.

Software para redução de dados
Geralmente, o software que acompanha o leitor de microplacas é uma parte muito subestimada do pacote. Para alguns leitores, o software controla apenas o processo de medição e fornece uma saída de dados brutos do ensaio. Em outros casos, pode realizar análises complexas de dados.

Um software abrangente, fácil de usar e flexível pode tornar a vida mais fácil, simplificar a detecção e a análise de dados para que você possa tirar o máximo proveito do seu instrumento.

Os recursos de cálculo mais úteis para ensaios de absorbância incluem subtração automática em branco, cálculo automático de concentrações com base em curvas padrão para ensaios ELISA ou na lei de Beer-Lambert, proporções 260/280, correções de comprimento de caminho e constantes enzimáticas como Km e Vmax.
No pacote de software BMG LABTECH, os ensaios mais comuns têm protocolos específicos de ensaios rápidos predefinidos e modelos de análise dedicados. Por meio dessas soluções dedicadas, a aquisição e a análise são realizadas com um único clique do mouse, permitindo que os pesquisadores realizem experimentos de maneira rápida e fácil.

Nossos leitores de microplacas de absorção

A detecção de absorvância pode ser realizada nos leitores de microplacas multimodo PHERAstar FSX, CLARIOstar Plus, VANTAstarTM, FLUOstar e SPECTROstar Omega, e nos leitores de placas de modo único SPECTROstar Nano.

Todos os nossos espectrofotômetros são equipados com uma lâmpada de xenônio de alta intensidade e um espectrômetro CCD.

A BMG LABTECH foi a primeira empresa a empregar um espectrômetro UV/vis ao invés de filtros ou monocromadores para detecção de absorbância. Após a iluminação da sonda por uma lâmpada de xenônio de alta potência, o espectrômetro UV/vis ultrarrápido da BMG LABTECH coleta todo o espectro em vez de um comprimento de onda específico. Ele captura todos os comprimentos de onda de 220 a 1000 nm em uma resolução de 1 a 10 nm em menos de 1 segundo por poço.

Alternativamente, a detecção de absorbância baseada em filtro (baseada em PMT) está disponível no FLUOstar Omega.