Nefelometria

O que é nefelometria?

Nefelometria (do grego nephelo: nuvem) é uma técnica de química analítica usada para medir a quantidade de turbidez ou turvação em uma solução causada pela presença de partículas insolúveis suspensas.

Quando direcionada por uma solução turva contendo partículas sólidas suspensas, a luz é transmitida, absorvida (bloqueada) e espalhada (refletida pelas partículas; fig. 1). A quantidade de luz dispersa depende do tamanho, da forma e da concentração das partículas insolúveis na solução, bem como do comprimento de onda da luz incidente.

As teorias e os conceitos sobre dispersão de luz foram inicialmente desenvolvidos no final do século XIX e início do século XX, principalmente por Rayleigh, Mie e Debye.

A nefelometria foi aplicada pela primeira vez no campo da química clínica a imunoensaios para a detecção e quantificação de proteínas séricas no sangue, como imunoglobulinas e macromoléculas. Essas aplicações ainda estão em uso atualmente. Aplicadas a leitores de microplacas, elas são usadas principalmente para analisar a precipitação de materiais (fig. 2), como a solubilidade de medicamentos e a agregação de proteínas, ou o crescimento bacteriano.

Diferença entre nefelometria e turbidimetria

A turbidez ou turvação pode ser detectada por nefelometria ou turbidimetria. Ambas as técnicas são não destrutivas e se baseiam na dispersão da luz causada por uma suspensão de partículas sólidas. Embora esses dois termos às vezes sejam usados como sinônimos, tecnicamente eles não são. Turbidimetria é o processo de medição da perda de intensidade da luz transmitida por uma amostra causada pelo efeito de dispersão de partículas insolúveis. Da mesma forma que a absorbância, a turbidimetria quantifica a intensidade da luz transmitida através da amostra, em particular sua atenuação. Na turbidimetria, a luz de um comprimento de onda conhecido passa por uma amostra contendo partículas insolúveis em solução. Um detector colocado em linha com a fonte de luz coleta a luz que passa pela amostra (fig. 3A). A diminuição da transmissão de luz é medida em comparação com uma referência, e a luz absorvida é quantificada como unidades de densidade óptica (DO).² Dessa forma, a turbidez pode ser medida, por exemplo, usando um leitor de microplacas de absorbância.

Em contrapartida, a nefelometria determina a turvação de uma solução quantificando diretamente a intensidade da luz dispersa por partículas insolúveis na amostra. Normalmente, a luz dispersa é medida em um ângulo relativo à fonte de luz incidente, para evitar a interferência da luz possivelmente transmitida (fig. 3B). Nesse aspecto, ela compartilha semelhanças com a medição da intensidade da fluorescência.

Nefelometria vs. turbidimetria

Ao executar ensaios de dispersão de luz, a escolha entre nefelometria ou turbidimetria é ditada principalmente por dois fatores.

• A concentração da amostra ea intensidade resultante da luz dispersa em relação à intensidade da fonte de luz é o fator mais relevante. Se a amostra contiver um pequeno número de partículas insolúveis (baixas concentrações), a intensidade da luz transmitida será aproximadamente comparável à intensidade da fonte de luz. Nesse caso, a nefelometria é a opção mais adequada. Como na absorção molecular, uma pequena diferença entre dois sinais intensos dificilmente pode ser determinada, a turbidimetria é mais adequada quando as amostras contêm uma alta concentração de partículas insolúveis e, portanto, a transmissão de luz é significativamente reduzida.

• O tamanho das partículas de dispersão éo segundo parâmetro a ser considerado, pois afeta a quantidade de luz que é refletida (bloqueada) ou dispersa. A reflexão ocorre quando o tamanho da partícula é maior do que o comprimento de onda da luz incidente. Se o tamanho da partícula for comparável ou menor que o comprimento de onda incidente, ocorrerá a dispersão. Dessa forma, a nefelometria é mais adequada para detectar partículas pequenas, sendo 0,1 - 1 μm o tamanho ideal, pois a dispersão predomina sobre a reflexão. O tamanho da partícula é menos relevante para a turbidimetria, pois a diminuição relativa da transmissão de luz é detectada. De fato, a detecção turbidimétrica ainda é viável mesmo quando o tamanho grande das partículas resulta em um aumento da reflexão ou refração.

Dessa forma, a nefelometria é mais adequada e oferece maior sensibilidade para a análise de partículas pequenas e suspensas em baixas concentrações. A turbidimetria geralmente é aplicada a partículas insolúveis relativamente grandes em altas concentrações. Por exemplo, ela é comumente usada em biologia para determinar o número de células (por exemplo, bactérias) em uma solução. 3

Princípio da nefelometria

A dispersão de luz emlíquidos segue as regras de dispersão elástica da física de partículas, em que nenhuma energia é absorvida por nenhuma das partículas durante a "colisão". A energia de um fóton antes e depois do evento de dispersão não é alterada. O espalhamento elástico é diferente em partículas grandes e pequenas. Para partículas grandes, a luz é espalhada principalmente na direção para frente (ângulo para frente). Quando o tamanho das partículas é menor que 5% do comprimento de onda da luz que as atinge, o espalhamento é distribuído simetricamente.⁴

As moléculas solúveis geralmente são pequenas em tamanho (em comparação com os comprimentos de onda da luz incidente) e se espalham de forma quase simétrica (fig. 4A). Por outro lado, os precipitados e complexos em solução têm normalmente um tamanho maior (mais próximo dos comprimentos de onda da luz incidente), produzindo predominantemente uma dispersão em ângulo frontal (fig. 4B). A detecção nefelométrica geralmente se concentra na medição da dispersão direta.

Dispersão e concentração de partículas

A intensidade da luz dispersa (_IS) e a concentração do precipitado (C) estão relacionadas pela seguinte equação:

I_S=k_S*I₀* C

em que k_S éuma constante determinada a partir de uma calibração do sistema e I₀ éa intensidade na fonte de luz.

As propriedades físicas de uma suspensão de partículas são influenciadas por diferentes variáveis. Embora a dispersão esteja relacionada à concentração de partículas sólidas em solução, a intensidade da luz dispersa também depende de seu tamanho e forma. Amostras igualmente concentradas contendo precipitados de tamanhos diferentes apresentarão níveis de dispersão diferentes.

Além disso, o tamanho e a forma do precipitado são afetados pela temperatura, pelo pH e pela concentração do reagente, bem como pela ordem da mistura, da agitação e do intervalo entre a formação do precipitado e a detecção. Para obter condições e resultados reproduzíveis entre amostras e ensaios, é necessário considerar todas essas diferentes variáveis^{.4, 5}

Comprimento de onda da fonte de luz

A seleção do comprimento de onda geralmente é irrelevante, pois a absorção da luz incidente pelas partículas em suspensão geralmente não é considerada, desde que não induza a fluorescência da amostra. Portanto, se forem usadas amostras não fluorescentes, não há necessidade específica de seleção do comprimento de onda. A escolha do comprimento de onda baseia-se principalmente na necessidade de minimizar possíveis interferências e, em vez disso, afeta a intensidade da luz incidente ou da própria dispersão.⁴

Instrumentação de nefelometria: como é detectada?

Embora os fluorômetros possam ser empregados para a detecção nefelométrica, a dependência angular da dispersão incentivou o desenvolvimento de dispositivos dedicados. Os turbidímetros com detectores localizados em um ângulo em relação ao feixe incidente são chamados de nefelômetros e são considerados o instrumento padrão para a medição de baixos valores de turbidez. Eles medem a intensidade da luz dispersa. A luz transmitida não é detectada.

Os componentes básicos desse dispositivo incluem uma fonte de luz, uma óptica de dispersão de luz e um detector. A fonte de luz gera um feixe que é direcionado através da amostra. Lâmpadas halógenas e de xenônio ou lasers podem ser usados como fontes de luz. Os lasers são normalmente a escolha mais comum, devido à sua sensibilidade, alta intensidade e natureza coerente (os fótons emitidos estão "em sintonia" uns com os outros). Os comprimentos de onda de entrada e de saída são idênticos e, portanto, não são opticamente selecionados.

Um detector é colocado em frente à fonte de luz e em um ângulo relativo ao feixe de luz que entra. Ele detecta variações na dispersão em ângulo frontal ou na dispersão lateral, dependendo de sua posição. Dependendo do ângulo em que a maior parte da dispersão pode ser coletada, os detectores podem ser colocados em ângulos de 30°, 70° ou 90°.

A nefelometria pode ser realizada como medição de ponto final ou cinética. As medições de ponto final quantificam a dispersão máxima de luz depois que uma reação atinge o equilíbrio ou em um ponto de tempo predeterminado. A detecção cinética (várias leituras ao longo do tempo) pode ser aplicada durante todo o processo de precipitação e geralmente fornece mais informações sobre a reação.

Aplicação da nefelometria

Desde a década de 1970, a imunonefelometria tem sido aplicada em laboratórios clínicos para a análise de imunoensaios. Ela foi originalmente usada para detectar a formação e a precipitação de complexos imunes (antígeno-anticorpo), uma aplicação que ainda é usada atualmente. A imunonefelometria também é usada para determinar a concentração de proteínas séricas, incluindo a imunoglobulina, bem como em coagulômetros automatizados de alto volume. Esses dispositivos quantificam os fatores de coagulação em amostras de sangue e permitem perfis de coagulação de vários ensaios.

Nos laboratórios farmacêuticos, a nefelometria é usada principalmente para avaliar a solubilidade de medicamentos ou compostos. Além disso, é um método promissor para a quantificação do crescimento microbiano e é comumente usado para determinar a contagem de células de suspensões de microrganismos, como leveduras (por exemplo, S. cerevisiae).⁶

Nefelometria baseada em microplacas

A nefelometria também pode ser detectada em microplacas (fig. 5). Esse formato é especialmente vantajoso para laboratórios de ciências biológicas e para o setor farmacêutico, uma vez que o manuseio de amostras e compostos com base em microplacas aumenta a eficiência e o rendimento. Os nefelômetros com base em microplacas geralmente proporcionam maior rendimento, simplicidade e abordagem de baixo volume para a coleta de dados de turbidez.O NEPHELOstar Plus foi desenvolvido pela BMG LABTECH, é o primeiro dispositivo de detecção nephelométrica baseado em laser e microplacas no mundo. Esse instrumento detecta partículas em solução em um poço de microplaca medindo a luz dispersa em ângulo frontal gerada quando um feixe de laser é direcionado através da amostra.

Como fonte de luz, um diodo de laser altamente colimado oferece intensidade e diâmetro de feixe ajustáveis. Esses recursos reduzem os problemas de menisco e otimizam a sensibilidade, permitindo medições em formatos de placas de 384 poços.

No NEPHELOstarPlus, o feixe de laser passa através do poço de amostra para uma esfera Ulbricht (esfera de integração) posicionada sob a microplaca. Essa esfera coleta a luz dispersa incidente em qualquer ponto de sua superfície interna e a distribui igualmente para todos os outros pontos por meio de múltiplas reflexões. A esfera de Ulbricht coleta a luz dispersa em um ângulo de até 80°, preserva sua intensidade, mas minimiza os ângulos de dispersão originais, eliminando assim as informações espaciais e produzindo luz difusa que pode ser quantificada pelo detector (fig. 6).

Se o feixe de luz não for desviado pelo precipitado no poço, ele passará direto pela esfera de Ulbricht, não haverá reflexão e, portanto, nenhum sinal chegará ao detector. Se houver partículas na amostra, a luz será espalhada, refletida no interior da esfera de Ulbricht e, por fim, medida por um detector posicionado em um ângulo de 90° em relação à luz incidente (fig. 7).

A turbidez é frequentemente expressa em NTUs (Unidades de Turbidez Nefelométrica), especialmente em testes de qualidade da água. Os valores de NTU podem ser derivados de um instrumento calibrado com base em medições comparativas com suspensões de formazina de referência. No entanto, esse é um processo demorado e de várias etapas que emprega grandes volumes de amostra. O NEPHELOstar Plus quantifica os resultados em unidades nefelométricas relativas (RNU). A forma como os NTUs podem ser comparados aos RNUs é descrita na nota de aplicação "Improving throughput for assessing nephelometric turbidity units (NTUs) using the NEPHELOstar Plus". A correlação entre as duas abordagens é mostrada na figura 8.

Qualidade das microplacas

Em geral, os ensaios nefelométricos são realizados em microplacas de 96 ou 384 poços. A qualidade óptica de uma microplaca é um aspecto extremamente importante. Imperfeições como poeira, sujeira, impressões digitais ou arranhões no fundo do poço podem dispersar a luz, gerando sinais falso-positivos, reduzindo a janela do ensaio ou levando a uma sensibilidade significativamente reduzida. Assim, os poços com valores particularmente altos ou com valores maiores que a média do branco mais dois desvios padrão geralmente não devem ser considerados.⁷

Aplicações da nefelometria baseada em microplacas

A nefelometria baseada em microplacas é uma ferramenta inestimável para o setor farmacêutico devido à sua aplicabilidade em triagens de solubilidade de compostos de alto rendimento. Além disso, pode ser usada para crescimento microbiano e cinética de ligação de proteínas, para medir a propensão à calcificação em fluidos corporais, fatores reumatoides no soro, ligação antígeno-anticorpo (fig. 9) e muito mais.

Ensaios de solubilidade de medicamentos

No setor farmacêutico,a triagem de alto rendimentoé um método importante para a descoberta de medicamentos. A avaliação da solubilidade nesse processo é obrigatória para determinar a validade dos resultados farmacológicos e a seleção de compostos promissores. A solubilidade do medicamento tem um grande impacto sobre a disponibilidade, a formulação, a dosagem e a absorção do medicamento. Por isso, é muito importante analisá-la no início do processo de descoberta de medicamentos para evitar telas ADME demoradas e caras de compostos de baixa solubilidade.

Tradicionalmente, os ensaios de solubilidade de equilíbrio têm sido determinados com rendimento limitado, agitando e incubando o composto com um solvente por pelo menos 24 horas, antes da filtração e da determinação da concentração por HPLC. Essa abordagem não atende mais aos requisitos da moderna descoberta de medicamentos.

Atualmente,as telas de solubilidade cinética automatizadas executadasem nefelômetros de microplacas proporcionam maior rendimento em menor tempo. Nessa abordagem, uma diluição em série do composto a ser testado é preparada em uma solução aquosa e pipetada em uma microplaca. O precipitado não dissolvido é detectado por dispersão de luz. Em altas concentrações, o composto precipitará, tornando a suspensão turva e fornecendo altas contagens de RNUs. Enquanto a concentração for maior do que a solubilidade, o composto precipitará. Quando a concentração for menor do que a solubilidade, o composto se dissolverá completamente, resultando em uma solução clara. Dessa forma, a dispersão e as contagens de RNUs serão significativamente reduzidas. Normalmente, dois ajustes lineares para as fases solúvel e insolúvel são aplicados aos dados. O ponto em que elas se cruzam é considerado o ponto de solubilidade cinética (fig. 10).

As vantagens dessa abordagem são a velocidade do ensaio e a facilidade de manuseio. Os ensaios nefelométricos baseados em microplacas exigem apenas etapas de pipetagem; não é necessário filtrar ou separar a fase da solução do resíduo não dissolvido. Além disso, nenhuma etapa de transferência de líquido é necessária, pois a configuração do ensaio e sua medição podem ser realizadas na mesma microplaca. Por fim, ele pode ser empregado para determinar a concentração em que um composto se torna solúvel e o ponto em que um soluto começa a precipitar.

Normalmente, o sinal detectado é linear para até 3 ordens de magnitude de concentração de partículas e um limite de detecção de cerca de 20 mmol/L pode ser alcançado para ensaios de solubilidade cinética.⁸

Crescimento microbiano

A nefelometria baseada em microplacas também pode ser usada como uma alternativa à detecção de crescimento microbiano baseada em absorbância OD600. À medida que as bactérias se multiplicam, o número de células que flutuam na solução aumentará, aumentando assim os níveis de dispersão e as contagens de RNU. Uma diluição em série da cultura é geralmente usada para relacionar a densidade óptica às contagens de RNU. A abordagem nefelométrica é comparável à baseada em absorbância, mas geralmente apresenta uma sensibilidade maior.

As notas de aplicação Monitoramento de curvas de crescimento microbiano por nefelometria a laser e Monitoramento nefelométrico do crescimento de Candida albicans(fig. 11) mostram como as curvas de crescimento podem ser medidas com eficiência no NEPHELOstarPlus.