CLARIOstar Plus
Most flexible Plate Reader for Assay Development
O que é intensidade de fluorescência?
A fluorescência é baseada na fotoluminescência, um processo de brilho e emissão de luz. É um processo físico no qual a luz é emitida depois de ter sido absorvida por uma substância. A intensidade da fluorescência indica a quantidade de luz (fótons) emitida. É a extensão da emissão e depende da concentração do fluoróforo excitado.
A fluorescência é criada pela absorção de energia (luz) por moléculas fluorescentes, chamadas de fluoróforos. A energia absorvida eleva os elétrons a um nível de energia mais alto. Como esse estado excitado é instável, os elétrons voltam ao estado fundamental e, assim, emitem luz (fig. 1).
Uma parte menor dos fótons absorvidos é convertida em movimento e calor. Assim, a energia liberada quando os elétrons retornam é sempre menor do que a energia necessária para excitar o elétron. Como a radiação de ondas mais altas é menos energética do que a radiação de ondas curtas, a emissão tem sempre um comprimento de onda maior do que a luz que foi usada para a excitação. A distância entre os máximos (picos) de excitação e emissão é chamada de deslocamento de Stokes (fig. 2).1
A característica de a luz de excitação (absorção) estar em um comprimento de onda menor do que a luz de emissão abre a possibilidade de usar a intensidade da fluorescência para fins analíticos. Os fluoróforos podem ser detectados excitando-os em um comprimento de onda específico e medindo a intensidade da emissão em um comprimento de onda maior. A intensidade da fluorescência é linearmente correlacionada à concentração do fluoróforo excitado e, consequentemente, é adequada para análises quantitativas.
A intensidade da fluorescência é amplamente utilizada em aplicações de ciências biológicas: em microscopia para localizar e quantificar biomoléculas, em citometria de fluxo para analisar células e em ensaios baseados em microplacas para quantificar moléculas, atividades enzimáticas e até mesmo a interação entre moléculas. Esta página se concentra no uso da intensidade de fluorescência em ensaios de microplacas, como ela é detectada, o que considerar nas medições de intensidade de fluorescência e quais ensaios são comumente usados.
Fluoróforos
Um fluoróforo (também fluorocromo) é um composto fluorescente que pode emitir luz quando excitado pela luz. São conhecidas milhares de moléculas que exibem características fluorescentes.2 Elasdiferem em:
Tamanho molecular
Muitos fluoróforos são compostos químicos com tamanho molecular pequeno que podem ser facilmente ligados a outras moléculas. As proteínas fluorescentes, como as proteínas fluorescentes verdes ou vermelhas (GFP ou RFP), são maiores em tamanho e podem ser expressas pelas células. Elas são usadas para marcar proteínas para estudos de expressão, para biossensores expressos endogenamente ou simplesmente como marcadores de quantificação celular. Leia comoa eficiência da transfecção baseadaem GFP e mcherry pode ser monitorada com precisão com o VANTAstar aqui.
Comprimentos de onda de excitação e emissão
As características de excitação e emissão de luz de um fluoróforo são exibidas como espectros: em um sistema de coordenadas, os nanômetros são indicados no eixo x e a intensidade no eixo y. As curvas são normalizadas para 100% e permitem a rápida identificação dos comprimentos de onda máximos de excitação e emissão, bem como do deslocamento de Stokes. Essas informações são importantes para escolher o fluoróforo correto para um ensaio. Ele precisa ser compatível com o sistema de detecção, com a possível autofluorescência e com outros fluoróforos, se vários forem usados em um experimento.
Rendimento quântico
O rendimento quântico é uma medida da eficiência com que uma molécula excitada converte os fótons absorvidos em luz de emissão. Em combinação com a extensão em que a luz é absorvida (coeficiente de extinção), o rendimento quântico fornece uma indicação do brilho de um fluoróforo.
Os pares FRET consistem em dois fluoróforos
A FRET (Transferência de energia por ressonância de Förster) descreve a transferência de energia de um fluoróforo doador para um fluoróforo aceitador. A transferência acontece quando o aceitador é excitado pela luz de emissão proveniente do doador e só ocorre se os dois fluoróforos estiverem próximos. O FRET é frequentemente usado para estudos de ligação molecular ou em biossensores. Os últimos mudam sua conformação quando a substância a ser analisada se liga e aproxima os dois fluoróforos. Para que a FRET ocorra, o par de fluoróforos precisa ter uma sobreposição entre o espectro de emissão do doador e o espectro de excitação do aceitador.3
Detecção da intensidade da fluorescência
Embora os fluoróforos sejam diferentes uns dos outros, a base das medições de intensidade de fluorescência em microplacas é a mesma (fig. 4):
- A luz de banda larga é produzida por uma fonte de luz
- A faixa de comprimento de onda de excitação é filtrada a partir da luz de banda larga
- A faixa de comprimento de onda de excitação excita o fluoróforo
- A faixa de comprimento de onda de emissão é filtrada a partir da luz de emissão
- Um detector quantifica a luz de emissão filtrada
Ao contrário da absorbância, a fluorescência não é uma medição absoluta. A intensidade do sinal fluorescente geralmente é relativa a outras medições ou a uma medição de referência feita por um instrumento. Consequentemente,os leitores de placas de fluorescência medem o sinal de luz emitido por uma amostra em Unidades Fluorescentes Relativas (RFU).
Fontes de luz
Há três fontes de luz comumente usadas em leitores de microplacas. Independentemente da fonte de luz com a qual seu leitor está equipado, seu desempenho pode afetar os resultados da medição. Leia mais na nota explicativa: Como o número de flashes influencia os resultados da medição?
Lâmpada de flash de xenônio
As lâmpadas de flash de xenônio emitemluz na faixa de 200 nm a 2500 nm. Portanto, elas são adequadas para excitar qualquer molécula que absorva luz desde a faixa de UV até a faixa de infravermelho. Elas apresentam uma alta saída de sinal e são de longa duração. Devido a essas vantagens, as lâmpadas de xenônio são usadas como fontes de excitação de fluorescência nos leitores de placas BMG LABTECH.
Lâmpada halógena de tungstênio
As lâmpadas halógenas emitem luz a partir de aproximadamente 360 nm e não são adequadas para medir a intensidade da fluorescência UV. Em comparação com as lâmpadas de xenônio, as lâmpadas de tungstênio têm uma vida útil mais curta, uma intensidade de saída mais baixa e resultam em menor sensibilidade, se usadas na detecção de fluorescência do leitor de microplacas.
LEDs
Os diodos emissores de luz (LEDs) emitem luz com alta intensidade, mas somente em uma largura de banda específica. Dessa forma, são necessários vários diodos para diferentes comprimentos de onda de excitação, o que torna a detecção flexível de vários fluoróforos mais complicada e cara.
Seleção de comprimento de onda
As fontes de excitação de banda larga podem abranger amplas faixas de comprimento de onda, desde a luz UV até a luz infravermelha. Para excitar especificamente o fluoróforo de interesse e evitar sinais inespecíficos, a luz de excitação de banda larga precisa ser selecionada (filtrada) para transmitir somente a luz em torno do máximo de excitação do fluoróforo. Da mesma forma, a luz de emissão é filtrada para o máximo de emissão do fluoróforo. Dessa forma, somente a fluorescência proveniente do fluoróforo de interesse é guiada para o detector. Dessa forma, a sensibilidade do ensaio é aprimorada com a otimização da faixa de comprimento de onda.
A sensibilidade da detecção em alguns leitores de microplacas de intensidade de fluorescência é aprimorada pelo uso de uma seleção adicional entre excitação e emissão: umespelho dicroico. Em geral, o espelho dicroico transmite luz superior a um comprimento de onda específico, mas bloqueia a luz em comprimentos de onda inferiores. O corte fica entre a excitação e a emissão e proporciona menor vazamento de luz de excitação para o detector.
Filtros
Os filtros ópticos são lâminas de vidro finas, redondas ou retangulares, com um revestimento óptico. O revestimento transmite apenas a luz de um determinado comprimento de onda. Fluoróforos com diferentes máximos de excitação e emissão precisam de filtros diferentes. Normalmente, um filtro recebe o nome do comprimento de onda médio de transmissão, que geralmente é o máximo de excitação ou emissão do fluoróforo. Além disso, um filtro óptico tem uma largura de banda definida (ou passagem de banda), que indica a amplitude da faixa de transmissão. Por exemplo, um filtro de 485 nm com uma largura de banda de 10 nm filtra a luz branca na faixa entre 480 e 490 nm.
Monocromadores
Ao contrário dos filtros ópticos, os monocromadores são capazes de selecionar a luz de diferentes comprimentos de onda, dependendo da necessidade. Dois tipos de monocromadores são usados em leitores de microplacas: monocromadores convencionais baseados em grade ou monocromadores de filtro variável linear. Nos monocromadores baseados em grades, os comprimentos de onda são selecionados pela difração da luz branca em suas cores. Os comprimentos de onda são então selecionados por uma fenda, que bloqueia fisicamente a luz indesejada e transmite apenas a desejada. A desvantagem do método de grade é a baixa transmissão de luz e a ocorrência de luz dispersa, que pode atingir o detector e reduzir a sensibilidade geral da fluorescência.
O monocromador de filtro variável linear (LVF) superao problema da luz dispersa, pois não quebra a luz, mas literalmente a filtra. O monocromador LVF usa duas lâminas com um revestimento gradiente. Qualquer comprimento de onda com qualquer largura de banda pode ser selecionado ao deslizar os dois filtros lineares um contra o outro. O monocromador LVF tem uma transmissão semelhante a um filtro, elimina a luz difusa e, portanto, tem um desempenho melhor do que os monocromadores de difração (fig. 6). O uso de Filtros Variáveis Lineares em leitores de microplacas é uma tecnologia patenteada pela BMG LABTECH.
Detector
A intensidade da fluorescência nas leitoras de microplacas é detectada com tubos fotomultiplicadores (PMTs). Eles multiplicam o sinal usando o efeito fotoelétrico e convertem a luz em um sinal elétrico. Para medições de intensidade de fluorescência em leitores de microplacas, são usados dois PMTs diferentes, que diferem em sua faixa de comprimento de onda sensível. Um PMT azul/verde de baixo ruído é sensível na faixa de até 740 nm e geralmente também é usado para medições de luminescência. Um PMT com desvio para o vermelho mede a fluorescência com sensibilidade até 900 nm e, portanto, também abrange corantes vermelhos e infravermelhos. Eles são usados com frequência para medições baseadas em células, pois a autofluorescência é reduzida nessa faixa de comprimento de onda.
Como configurar uma medição de fluorescência em um leitor de placas
Microplaca
As quantificações de intensidade de fluorescência exigem uma placa preta, pois ela reduz o fundo e a reflexão da luz de excitação. Mais detalhes sobre a escolha da placa podem ser encontrados em nossa publicação no blog "A microplaca: utilidade na prática".
Configurações de filtro e monocromador
A escolha do filtro correto é essencial para uma determinação precisa da intensidade da fluorescência. Como já mencionado, os comprimentos de onda médios devem estar no máximo de excitação e emissão ou próximos a eles. Entretanto, há alguns aspectos que devem ser levados em conta:
a) Distância entre os filtros
Se as bordas dos filtros de excitação e emissão estiverem muito próximas uma da outra, a luz de excitação pode vazar e atingir o detector. Então, o sinal do fluoróforo desaparece na luz de excitação e não é mais mensurável. A proximidade entre os filtros depende da qualidade dos filtros e do uso de um espelho dicroico. Normalmente, os comprimentos de onda mais altos de excitação transmitida e os comprimentos de onda mais baixos de emissão transmitida devem estar separados por 30 nm (fig. 7).
b) Largura de banda
A passagem de banda dos filtros varia de alguns nanômetros a 100 nm. A passagem de banda afeta a quantidade de luz que pode passar pelo filtro. Os filtros de baixa largura de banda (~10 nm) são recomendados para fluoróforos brilhantes ou para amostras complexas com alta autofluorescência. Um exemplo típico são os fluoróforos verdes, como AlexaFluor488, FITC ou GFP em um ambiente celular.
Filtros de largura de banda mais ampla são recomendados para fluoróforos de baixa emissão se eles emitirem em uma faixa em que a autofluorescência é baixa (emissão <600nm) ou se o buffer não contiver nenhum outro composto fluorescente. A BMG LABTECH seleciona os filtros com base nos espectros de excitação e emissão do fluoróforo. Além disso, os pares de filtros são medidos e combinados entre si para que você possa ter certeza de que está recebendo os melhores filtros possíveis. As configurações padrão para fluoróforos comuns também já estão armazenadas para o monocromador, para que esse trabalho de seleção não fique a cargo do pesquisador.
c) As medições FRET exigem dois canais de emissão
As considerações acima também se aplicam às medições FRET. No entanto, é preciso observar que duas emissões devem ser registradas separadamente. O fluoróforo doador excitado emite luz em um comprimento de onda específico se nenhum aceitador estiver por perto. Se um fluoróforo aceitador estiver próximo, o doador transfere a energia para o aceitador, que então emite luz em um comprimento de onda maior. Isso significa que são necessários dois filtros de emissão, um dos quais permite que apenas a emissão do doador e o outro apenas a emissão do aceitador sejam transmitidas.
Ganho
O ganho de fluorescência éum fator de amplificação ou, mais precisamente, a tensão do detector na qual o sinal de luz recebido é amplificado. A alteração do ganho move a faixa dinâmica de detecção ao longo da curva de concentração do analito/ensaio. Entretanto, a largura do intervalo dinâmico é fixa e não muda.
Os sinais fracos precisam de uma amplificação grande (ganho alto), e os sinais brilhantes precisam de menos amplificação (ganho pequeno). Um ganho selecionado incorretamente pode tornar os dados medidos inutilizáveis porque eles excedem a faixa de medição ou as diferenças não são mais resolvidas. Os dados que destacam esses efeitos podem ser encontrados na Nota de instruções: Como otimizar a configuração de ganho do seu leitor de microplacas? Normalmente, o ganho é definido para ter uma saída de medição máxima na amostra com a maior intensidade esperada. Isso é feito para que se tenha a maior janela dinâmica possível entre os valores de medição mais altos e mais baixos (fig. 8).
Todas as leitoras de microplacas BMG LABTECH determinam o ganho automaticamente, desde que seja identificado um poço específico com uma intensidade de sinal específica. Entretanto, no CLARIOstarPlus e no VANTAstar, nãoé necessário nenhumajuste de ganho. A tecnologia Enhanced Dynamic Range (EDR) foi projetada especificamente para oferecer a maior faixa dinâmica possível - 8 décadas de concentração. Isso proporciona aos pesquisadores uma conveniência sem precedentes nas medições em microplacas, pois resultados altamente confiáveis podem ser medidos em uma ampla faixa dinâmica sem intervenção manual.
Altura focal
A altura em que um sinal é detectado tem um impacto significativo sobre a sensibilidade da medição. A medição em uma altura focal não ideal pode reduzir o sinal em até 90%. Por exemplo, as células fluorescentes aderentes precisam ser medidas perto do fundo da placa, enquanto uma solução fluorescente homogênea fornece o sinal mais alto logo abaixo da superfície do líquido e depende do volume de preenchimento do poço. Alguns leitores de placas determinam a altura focal ideal em um poço selecionado. O CLARIOstar® Plus e o VANTAstar® vãoainda mais longe e determinam a altura focal automaticamente durante a leitura da placa.
Ensaios fluorescentes - Para que é usada a intensidade da fluorescência?
O número de ensaios fluorescentes é tão grande quanto o número de perguntas biológicas e químicas que eles podem responder. Portanto, as aplicações mais comuns baseadas na intensidade da fluorescência estão descritas abaixo.
Ensaios de viabilidade celular e citotoxicidade
Se as células são prejudicadas por um composto ou se as células cancerosas morrem após o tratamento são perguntas comuns respondidas por ensaios de viabilidade e citotoxicidade fluorescentes e leitores de microplacas. No ensaio alamarBlue™, a resazurina é reduzida pelas células metabolicamente ativas a um fluoróforo e informa sobre a viabilidade celular. Outra maneira de avaliar a viabilidade celular é a incorporação de nucleosídeos marcados com fluorescência no DNA. Esses nucleosídeos são incorporados e, consequentemente, fluorescem somente se houver replicação do DNA, um marcador de viabilidade.
Uma maneira de detectar a morte celular por intensidade de fluorescência baseia-se em corantes de DNA fluorescentes, como SYBR® Greenou Celltox™ Green. Os corantes não são permeáveis às células, mas são expostos ao DNA em solução caso a membrana celular seja rompida durante a morte celular e, em seguida, começa a fluorescer (fig. 9). Esses ensaios são compatíveis com medições em tempo real e podem monitorar a saúde da célula ao longo do tempo. Como essas medições são feitas durante dias, a câmara da microplaca precisa ser incubada a 37 °C e com 5% de CO2 paramanter as células satisfeitas. O CLARIOstar Plus com Unidade de Controle Atmosférico provoufornecer a atmosfera ideal para experimentos de longo prazo baseados em células. Mais ensaios de saúde celular estão descritos em nossa postagem no blog "Ensaios de viabilidade celular - Meça a satisfação de suas células".
Ensaios de atividade enzimática
Como as enzimas estão envolvidas em vários processos biológicos, é importante estudar como os inibidores ou promotores influenciam as atividades enzimáticas. Os princípios dos ensaios enzimáticos são comparáveis: eles empregam um substrato pré-fluorescente que, após o processamento da enzima, libera um fluoróforo. Os fluoróforos comuns são baseados em derivados de cumarina, como noensaio baseado em fluorescência da enzima epigenética histona desacetilase 1 (HDAC1), em que podem ser usados para investigar a inibição de histona desacetilases.
Um segundo fluoróforo usado em ensaios de enzimas é a 4-metilumbeliferona. Um exemplo é encontrado na nota de aplicação "CLARIOstar determina a atividade de uma alfa-glucosidase ácida humana (GAA) produzida por musgo em um ensaio baseado em fluorescência". O leitor de microplacas multimodo CLARIOstarPlus facilita a análise da atividade enzimática fluorescente. A tecnologia Enhanced Dynamic Range permite a leitura em uma faixa dinâmica de 8 décadas. Dessa forma, o sinal crescente nos ensaios de atividade enzimática é facilmente registrado sem o risco de escolher um ganho incorreto ou uma otimização demorada do instrumento. O instrumento é fornecido com um software de análise gratuito com análise cinética enzimática integrada que abrange a modelagem Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk(medições cinéticas enzimáticas realizadas em um leitor de microplacas BMG LABTECH).
Alterações conformacionais: dobragem e desdobragem de proteínas
A fluorescência de aminoácidos de ocorrência natural, como o triptofano, também pode ser usada para medir as alterações conformacionais e a atividade enzimática das proteínas. Alguns exemplos de aplicações estão descritos em nossa publicação no blog Fluorescência do triptofano: a sonda da natureza. A fluorescência do triptofano é útil, por exemplo, para a triagem de novas terapêuticas para alvos de medicamentos, como os receptores acoplados à proteína G, um dos alvos mais populares para medicamentos aprovados no mercado atualmente.
Ensaios de agregação de proteínas
As proteínas se agregam se estiverem mal dobradas e a agregação está relacionada a doenças como Alzheimer, Parkinson e doença priônica. A análise da formação de agregados moleculares ajuda a diagnosticar e entender essas doenças, além de testar possíveis medicamentos. Os dois fluoróforos bis-ANS e tioflavina T (ThT) aumentam sua intensidade de fluorescência na interação com agregados de proteínas. O Bis-ANS interage preferencialmente com agregados amorfos, conforme descrito na nota de aplicação "Uso de um leitor de microplacas BMG LABTECH para monitorar a formação de amiloides".
O ThT se liga a fibrilas e é usado principalmente em ensaios cinéticos. Se a amostra contiver moléculas indutoras de agregação, as proteínas recombinantes se agregam e a fluorescência aumenta (fig. 10).
A nota de aplicação "Real-time quaking-induced conversion assay for prion seeding" explica como o ensaio é usado para detectar a doença priônica scrapie em homogenatos de cérebro de hamster. Como esses ensaios de agregação exigem agitação de longo prazo, os leitores de microplacas da BMG LABTECH podem ser equipados com sistemas de transporte muito robustos e duráveis.
