PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
¿Qué es TR-FRET?
La FRET resuelta en el tiempo (TR-FRET) es una tecnología de detección que combinala fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) conla transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). TR-FRET se utiliza principalmente para analizar eventos de unión y para el cribado de fármacos de alto rendimiento.
La transferencia de energía de resonancia de Förster describe una transferencia de energía entre dos fluoróforos. Recibe su nombre del científico alemán Theodor Förster, quien desarrolló originalmente la teoría de la transferencia de energía de resonancia.1 Paraque tenga lugar, un fluoróforo donante que ha absorbido energía durante la excitación y se encuentra en un estado electrónicamente excitado, transfiere energía a un segundo fluoróforo aceptor. La transferencia de energía reduce la intensidad de emisión del donante y aumenta la del aceptor.
La transferencia de energía depende de dos condiciones. En primer lugar, la proximidad espacial entre el donante y el aceptor debe estar comprendida entre 20 y 90 Å. La transferencia de energía de resonancia es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre el donante y el aceptor, por lo que es muy sensible a los cambios de distancia. En segundo lugar, se requiere un solapamiento entre el espectro de emisión del donante y el espectro de excitación del aceptor. Los "pares FRET" requieren una distancia suficiente en los picos de emisión para ser ópticamente distinguibles, pero al mismo tiempo un solapamiento espectral suficiente para permitir una transferencia de energía eficiente (fig. 1A).
En biología, las proteínas fluorescentes codificadas genéticamente son las más utilizadas. Las más populares son la proteína verde fluorescente (GFP), la proteína roja fluorescente (RFP), la proteína cian fluorescente (CFP) y la proteína amarilla fluorescente (YFP).2
La FRET se utiliza generalmente para estudiar interacciones moleculares o eventos de unión y puede emplearse para determinar laafinidad de unión dedos socios de unión. La FRET se utiliza generalmente para estudiar interacciones moleculares o eventos de unión y se puede emplear para determinar la afinidad de unión de dos socios de unión, que se evalúan vinculando cada socio de unión a investigar a un fluoróforo y detectando el nivel de transferencia de energía que tiene lugar (fig. 1 B, C). Sin embargo, dado que la FRET estándar se ve afectada negativamente por el ruido de fondo derivado de la luz de excitación dispersa y la autofluorescencia, difícilmente se pueden obtener mediciones altamente sensibles con este enfoque.
Principio TR-FRET
La FRET resuelta en el tiempo elimina el ruido de fondo de corta duración derivado de la dispersión de la luz de excitación y de la autofluorescencia gracias a la adopción de la fluorescencia resuelta en el tiempo y a la introducción de una detección retardada en el tiempo. Esto es posible gracias al uso de lantánidos como donadores. Estos fluoróforos tienen grandes desplazamientos de Stokes y tiempos de emisión de hasta milisegundos.
La TR-FRET se basa en la transferencia de energía de resonancia que tiene lugar entre un lantánido y un fluoróforo de vida corta, cuando están próximos. Debido a estas propiedades, ha mejorado la estabilidad y la especificidad con respecto a la FRET estándar. La interferencia del tampón o del medio se reduce significativamente por la fluorescencia de larga duración y por la detección ratiométrica de las dos longitudes de onda de emisión del donante y del aceptor.
El principio general de aplicación de esta tecnología es muy similar en los distintos fabricantes de kits, entre los que destacan HTRF®, LANCE®,LanthaScreenTM y THUNDERTM. El donante y el aceptor se unen covalentemente a las partes que interactúan o se marca un anticuerpo específico contra cada una de las dos dianas (o etiquetas) con el donante o el aceptor. Al excitar el donante, la energía se transfiere al aceptor, que emite por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia si las dianas están próximas. La emisión es proporcional a la cantidad de unión que tiene lugar.
Tecnología TR-FRET
En la TR-FRET se utilizan diferentes fluoróforos que forman diferentes pares, dependiendo del fabricante.
- Los lantánidos donantes son el europio o el terbio (fig. 2). Dado que los iones de europio y terbio son escasamente fluorescentes, necesitan estar incrustados en una "jaula" colectora de luz para emitir luz. Para ello se utilizan quelatos y criptatos, que permiten tanto la captación como la transferencia de energía. En comparación con el europio, el terbio tiene un rendimiento cuántico entre 10 y 20 veces mayor y un coeficiente de extinción molar más elevado, que se relaciona con la absorbancia de una molécula. Ambas características mejoran el rendimiento del cribado.3 Elcomplejo quelato/cripto-lantánido es supuestamente muy estable en una amplia gama de condiciones químicas y no sufre fotoblanqueamiento como los fluoróforos convencionales.
- Los aceptores son fluoróforos convencionales que emiten en las gamas verde y roja. Para la transferencia de energía por resonancia, los fluoróforos rojos pueden combinarse con europio o terbio, mientras que los verdes suelen combinarse con terbio.
Detección TR-FRET
Los lantánidos suelen excitarse a 320 - 340 nm. La emisión del europio se detecta normalmente a 620 nm, mientras que la del terbio puede detectarse a 490 o 620 nm dependiendo del kit y del fabricante. Para los aceptores, la emisión es de 520 nm para los fluoróforos verdes o de 665 nm para los rojos. La emisión del donante se utiliza como referencia interna, mientras que la emisión del aceptor es un indicador de la transferencia de energía (evento de unión) que tiene lugar (fig. 3).
Entre la excitación y la detección de fluorescencia se aplica un retardo de tiempo del orden de microsegundos. De este modo se elimina la fluorescencia de fondo inespecífica de corta duración. La emisión se detecta entonces normalmente durante un periodo de tiempo (ventana de medición) de microsegundos (fig. 4). Dependiendo del kit y del fabricante, los ajustes del retardo temporal y de la ventana de medición pueden variar.
A continuación, se calcula una relación de las señales integradas en el tiempo de los dos canales de emisión. Esta medición ratiométrica normaliza la señal, elimina las interferencias del medio y la extinción, y corrige los errores de manipulación de líquidos o la variabilidad entre pocillos.
Ventajas de TR-FRET
La sensibilidad y la versatilidad han hecho que los ensayos TR-FRET sean muy populares. La combinación de detección resuelta en el tiempo y mediciones ratiométricas aumenta significativamente la ventana de ensayo y reduce el fondo. Además, la emisión de lantánidos apenas se decolora, es estable en el tiempo y compatible con diferentes reactivos y condiciones experimentales.
A pesar de estos beneficios, la mayor ventaja de este método es probablemente que la detección del par unido no requiere separación física de los componentes no unidos para reducir el fondo. Como ensayo homogéneo, el TR-FRET no necesita pasos de lavado intermedios y puede realizarse como un simple ensayo de adición y lectura (fig. 5), minimizando los pasos de manipulación y siendo más conveniente y consumiendo menos tiempo quelos ELISA. En consecuencia, es especialmente adecuado para campañasautomatizadasde cribado HTS.
Sin embargo, el apagado de la señal generado por interacciones externas con el proceso de excitación intramolecular o la fluorescencia de los compuestos de la biblioteca o las proteínas biológicas puede suponer una limitación3.
Diferentes kits TR-FRET
Existen kits de ensayo TR-FRET de diferentes fabricantes. Aunque todos los ensayos se basan en una tecnología común y todos pueden detectarse en unlector de microplacas, existen diferencias entre los kits y los fabricantes. Éstas están relacionadas principalmente con los diferentes tipos de donantes y aceptores, sus combinaciones y los diferentes tiempos para el inicio de la detección y la ventana de medición.
- HTRF: La fluorescencia homogénearesuelta en el tiempo esuna tecnología que emplea cuatro fluoróforos específicos que forman pares diferentes. El lantánido es un criptato de europio o de terbio. Los aceptores emiten en la gama del rojo: el XL665 de primera generación, basado en un pigmento purificado de algas rojas, y el d2 de segunda generación, similar al XL665 pero de menor tamaño. Ambos pueden combinarse con cualquiera de los dos criptatos. Además, el terbio puede combinarse con fluoróforos verdes, lo que permite una posible multiplexación (fig. 6).
- LANCE: Lanthanide Chelate Excite es una tecnología TR-FRET basada en un quelato de europio y dos moléculas aceptoras diferentes, Surelight® APCy ULight™. Esta última es un fluoróforo mejorado de segunda generación con un peso molecular menor (< 800 Daltons).
- LanthaScreen: basado originalmente en europio y aloficocianina (APC) o Alexa Fluor647,LanthaScreen seoptimizó finalmente para utilizar terbio y fluoresceína o GFP. Se supone que el uso de terbio mejora la flexibilidad. El APC se utiliza normalmente como conjugado de estreptavidina debido a su gran masa molecular (>100 kDa) y se acopla a un sustrato biotinilado en un complejo trimolecular. En combinación con el terbio, la fluoresceína y la GFP pueden utilizarse para etiquetar directamente sustratos, superando así los problemas estéricos del europio-APC. Además, el uso de GFP permite realizar ensayos basados en proteínas de fusión GFP, incluso en células vivas.
- Ensayos Transcreener® TR-FRET: detectan ADP, AMP/GMP, UDP y GDP como subproductos de reacciones enzimáticas biológicas comunes. Existen inmunoensayos TR-FRET competitivos para cada nucleótido. Su cuantificación se utiliza para analizar la actividad enzimática de las enzimas dependientes de nucleótidos. Los ensayos Transcreener utilizanuna configuración competitiva en la que los anticuerpos se unen a un quelato de terbio y los nucleótidos a un fluoróforo rojo. El desplazamiento del trazador por ADP, AMP/GMP, UDP y GDP "nativos" impide la transferencia de energía de resonancia. De este modo, la presencia de moléculas diana puede reconocerse por una reducción de la señal.
- THUNDERTR-FRET: se trata de una tecnología basada en un par FRET que muestra una compatibilidad espectral y una señal TR-FRET mejoradas. Los ensayos THUNDER utilizan un quelato de europio de larga duración y gran estabilidad como donante, mientras que el aceptor es un fluoróforo de pequeño peso molecular que emite en el rango del rojo lejano.5
En la tabla 1 se resumen todas las tecnologías de ensayo y sus características, incluidos los picos de excitación y emisión. Además de las características descritas, estos kits varían también en sus tiempos de intervalo y ventanas de ensayo.
Tabla 1: comparación de los kits de ensayo TR-FRET más populares y sus picos de excitación y emisión
| Kit | Donante | Tipo de jaula | Excitación | Emisión | Aceptador | Emisión |
| LANCE | Europio | Quelato | 320 nm | 620 nm | ULightTM | 665 nm |
| LANCE | Europio | Quelato | 320 nm | 620 nm | Surelight® APC | 665 nm |
| LanthaScreen Eu | Europio | Quelato | 320 nm | 620 nm | AlexaFluor 647 | 665 nm |
| LanthaScreen Tb | Terbio | Quelato | 340 nm | 490 nm | Fluoresceína/GFP | 520 nm |
| HTRF Rojo (Eu) | Europio | Criptato | 320 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
| HTRF Rojo (Tb) | Terbio | Criptato | 340 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
| Verde HTRF (Tb) | Terbio | Criptato | 340 nm | 620 nm | Fluoresceína/GFP | 520 nm |
| Transcreener TR-FRET | Terbio | Quelato | 340 nm | 620 nm | HiLyte647 | 665 nm |
| Quelato | de europio | THUNDER | 320 nm | 620 nm | Colorante rojo lejano | 665 nm |
Además del uso de kits disponibles comercialmente, los pares donante y aceptor TR-FRET también pueden combinarse libremente, siempre que el espectro de emisión del donante muestre un solapamiento suficiente con el espectro de excitación del aceptor, como se muestra en AN 388: Differential binding of ∆9-tetrahydrocannabinol derivatives to type 1 cannabinoid receptors (CB1).
Lector de microplacas TR-FRET
La detección FRET resuelta en el tiempo se realiza predominantemente en lectores de microplacas. La configuración básica de un lector de placas TR-FRET consiste en una fuente de luz, filtros de excitación y emisión para la selección de la longitud de onda y un detector de tubo fotomultiplicador (PMT). Además del modo de detección TRF, los lectores de placas tienen que ser capaces de medir dos canales de emisión en una pasada, ya sea secuencial o simultáneamente. Dado que la TR-FRET se utiliza principalmente en el cribado de alto rendimiento, la compatibilidad con microplacas de 384 y 1536 pocillos suele ser obligatoria.
Fuentes de luz
Los complejos de quelato o criptato suelen excitarse a 320 - 340 nm. Por lo tanto, como fuente de luz se puede utilizar tanto una lámpara de flash de xenón como un láser de excitación específico. Un láser TRF concentra más energía en este rango específico de longitudes de onda y permite obtener mejores resultados con una mejor discriminación entre señales bajas y altas.
El PHERAstar FSX está equipado con un láser TRF con una frecuencia de destello de 60 hercios, lo que proporciona una ventaja de velocidad significativa para la detección TR-FRET. El láser permite la medición de una placa completa de 1536 pocillos en 36 segundos manteniendo una Z' > 0,8 para ensayos celulares y bioquímicos (fig. 7), como se muestra en la nota de aplicación "Cellular and biochemical HTRF assays measured in 1536-well microplates" (Ensayos HTRF celulares y bioquímicos medidos en microplacas de 1536 pocillos).
En la nota de aplicaciónExcellent assay performance of THUNDER™ TR-FRET cell-based cytokine assays performed on the PHERAstar FSX, se muestra cómo el PHERAstar FSX con láser TRF exhibe una sensibilidad y un rango dinámico mucho mayores que un lector de microplacas HTS de la competencia.
Detectores dedicados
El PHERAstarFSX está equipado con detectores de recuento de fotones (PMT) para la detección TR-FRET. Los detectores ordinarios proporcionan como salida un valor de integración para el área bajo la curva durante el tiempo de integración. En cambio, los PMT de recuento de fotones cuentan cada fotón individual y, por lo tanto, monitorizan toda la curva de desintegración del lantánido.
En el lector PHERAstar FSX, la detección por recuento de fotones permite medir y mostrar la curva de decaimiento de la emisión con una resolución temporal de 2 microsegundos. Esta función exclusiva, denominada monitorización de la curva de des integración , simplifica el desarrollo del ensayo y ayuda a optimizar los parámetros de temporización, mejorando la detección y reduciendo el fondo. Junto con el Asistente de Integración, la Monitorización de la Curva de Decaimiento ofrece una plataforma para la optimización de ensayos TR-FRET.
Detección de doble canal
Se requiere la detección de las dos longitudes de onda de emisión, ya sea secuencial o simultáneamente. Comúnmente, los lectores de microplacas miden las dos emisiones una tras otra. Sin embargo, la detección simultánea tiene varias ventajas.
El sistema de detección de doble emisión simultánea (SDE) del PHERAstarFSX utiliza dos PMT emparejados para la medición paralela de las 2 longitudes de onda de emisión. De esta forma, el SDE reduce los tiempos de lectura a la mitad y aumenta el rendimiento, al tiempo que corrige las variaciones causadas por las diferencias en el volumen de relleno, las concentraciones o las fluctuaciones en la energía de excitación. Estas características mejoran la sensibilidad y reducen los %CV. Las mediciones SDE de un solo canal se combinan para el cálculo ratiométrico de los resultados de ambos canales de emisión.
Miniaturización de ensayos TR-FRET
En el cribado de fármacos, la reducción de escala del ensayo es un paso clave. El objetivo de la miniaturización es reducir los volúmenes de muestra manteniendo la reproducibilidad, fiabilidad y robustez del ensayo. Los ensayos pueden reducirse a placas de 3456 pocillos, aunque los formatos más comunes son los de 384 y 1536 pocillos.
Los ensayos TR-FRET pueden miniaturizarse manteniendo la precisión y la reproducibilidad, ya que la intensidad de la señal no depende de la cantidad de un trazador, sino de su concentración. Esto se ve reforzado por el uso de un lector de placas de alta sensibilidad como el PHERAstarFSX.
En la charla científica "Successfully downscaling screening assays: Servier's experience", presentamos un estudio de caso en el que el lector de placas PHERAstarFSX contribuyó significativamente a la miniaturización de un ensayo HTRF del formato de 384 pocillos al de 1536 pocillos. En el PHERAstarFSX, la miniaturización se combinó con la dilución adicional de reactivos y con la detección "sobre la marcha" (sólo un flash por pocillo). Esto dio lugar avalores Z' de alta calidad y a una reducción significativa del uso de reactivos y del consumo de tiempo.
Ensayos de actividad cinasa
La actividad quinasa se analiza principalmente con ensayos tipo sándwich que miden el cambio de fosforilación de un sustrato, como se muestra en la nota de aplicaciónAnálisis de la fosforilación de ERK1/2, p38αβγ y STAT3 con los inmunoensayos de quinasas celulares THUNDER™ TR-FRET. También pueden emplearse ensayos de competición para monitorizar diferentes productos generados por la reacción (por ejemplo, ADP). Alternativamente, se utiliza un sustrato de quinasa marcado con fluorescencia y un anticuerpo antifosfo marcado con lantánidos (fig. 8), como se muestra en la nota de aplicación "LanthaScreen TR-FRET tyrosine kinase and protein kinase C assay". Estos métodos también pueden aplicarse a las proteasas y a la ubiquitinación. Para más información sobre la detección de la actividad de las quinasas, visite nuestra entrada del blog "Ensayos de quinasas".
GPCRs
Los ensayos para estudiarlos receptores acoplados a proteínas G (GPCR) pueden ser mecanísticos o funcionales. Los ensayos funcionales se centran principalmente en la cuantificación de mensajeros secundarios (por ejemplo, IP1 o AMPc), ya que éstos pueden acumularse en la célula como consecuencia de la actividad de inhibidores específicos. En consecuencia, los segundos mensajeros se utilizan como indicador, ya que su concentración se correlaciona con la unión del ligando y la participación del receptor. Esto se muestra en las notas de aplicación "HTRF IP-One assay used for functional screening" y "GPCR activation is measured using Cisbio's cAMP and IP1 HTRF HTplex cell-based assay". Los ensayos mecanísticos se centran en la organización y oligomerización del receptor en la membrana celular para mediar la señalización.
Biomarcadores
El análisis de los productos de la señalización descendente puede utilizarse para identificar vías aberrantes, que posiblemente desempeñen un papel en enfermedades neurológicas, metabólicas e inflamatorias. La FRET resuelta en el tiempo puede utilizarse para probar la eficacia de compuestos dirigidos específicamente a estas enfermedades. Entre los ejemplos de aplicación se incluyen el "Desarrollo de un ensayo rápido de insulina HTRF" para enfermedades metabólicas, en particular la diabetes mellitus, la "Detección de la agregación de la proteína tau humana" enenfermedades neurodegenerativas y elexcelente rendimiento de los ensayos de citoquinas basados en células THUNDER™ TR-FRET realizados en el PHERAstar FSX para la cuantificación de citoquinas en diferentes enfermedades.
En la charla científica "Targeting the type 1 cholecystokinin receptor to screen for novel obesity treatments " se explica cómo se utilizó un ensayo TR-FRET para detectar la acumulación de monofosfato de inositol, un metabolito derivado del IP3. A partir de estos resultados, se desarrolló un ensayo de unión basado en TR-FRET.
Análisis de los eventos cinéticos de unión
Debido a las dificultades técnicas y al relativamente bajo rendimiento, la cinética de la unión ligando-receptor se ha estudiado tradicionalmente en un momento tardío del descubrimiento de fármacos. Sin embargo, el descubrimiento de fármacos se beneficiaría enormemente de su optimización, ya que las tasasKon y Koff influyen en la eficacia, la aparición de efectos secundarios y la eficacia y duración de la acción. Además, la cinética de unión parece desempeñar un papel en el agonismo sesgado. Por lo tanto, es deseable examinar la cinética de unión de los fármacos candidatos en una fase temprana, antes de pasar a los modelos in vivo y a los estudios clínicos.
Los estudios de cinética de unión (fig. 9) pueden realizarse eficazmente en lectores de placas que permiten la detección cinética TR-FRET con fines de cribado y el estudio cinético de compuestos de baja afinidad, como se explica en la charla científica "A TR-FRET approach to measure the kinetics of ligand-receptor binding and its application of fragment screening" y en la nota de aplicación "Analyze binding kinetics with HTRF".
