PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
TR-FRET이란 무엇인가요?
시간 분해형광법(TR-FRET)은시간 분해 형광법(TRF)과포스터 공명 에너지 전달법(FRET)을 결합한 검출 기술입니다. TR-FRET은 주로 결합 이벤트 분석과 고처리량 약물 스크리닝에 사용됩니다.
푀르스터 공명 에너지 전달은 두 형광체 사이의 에너지 전달을 설명합니다. 공명 에너지 전달 이론을 처음 개발한 독일 과학자 테오도르 푀스터의 이름을 따서 명명되었습니다.1 공명 에너지 전달이 일어나려면여기 시 에너지를 흡수하여 전자 여기 상태가 된 기증 형광체가 두 번째 억셉터 형광체로 에너지를 전달해야 합니다. 에너지 전달은 도너의 방출 강도를 감소시키는 동시에 억셉터의 방출 강도를 증가시킵니다.
에너지 전달은 두 가지 조건에 따라 달라집니다. 첫째, 공명 에너지 전달은 도너와 억셉터 사이의 공간적 근접성이 20 - 90Å 범위여야 합니다. 공명 에너지 전달은 도너와 억셉터 거리의 6승에 반비례하므로 거리 변화에 매우 민감합니다. 둘째, 도너의 방출 스펙트럼과 억셉터의 여기 스펙트럼 사이에 중첩이 필요합니다. "FRET 쌍"은 방출 피크에서 광학적으로 구별할 수 있을 만큼 충분한 거리가 필요하지만 동시에 효율적인 에너지 전달을 위해 충분한 스펙트럼 중첩이 필요합니다(그림 1A).
생물학에서는 유전자로 코딩된 형광 단백질이 가장 일반적으로 사용됩니다. 가장 많이 사용되는 형광 단백질로는 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 시안 형광 단백질(CFP), 노란색 형광 단백질(YFP)이 있습니다.2
FRET은 일반적으로 분자 상호작용 또는 결합 이벤트를 연구하는 데 사용되며, 두 결합 파트너의결합 친화도를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 조사할 각 결합 파트너를 형광체에 연결하고 일어나는 에너지 전달 수준을 감지하여 평가합니다(그림 1 B, C). 그러나 표준 FRET은 산란된 여기광과 자가 형광에서 파생되는 배경 잡음의 영향을 받기 때문에 이 접근법으로는 고감도 측정을 거의 얻을 수 없습니다.
TR-FRET 원리
시간분해형 형광을 채택하고 시간 지연 검출을 도입하여 산란된 여기광과 자가 형광에서 발생하는 단시간 배경 노이즈를 제거한 시간분해형 FRET. 이는 란타나이드를 공여체로 사용함으로써 가능합니다. 이러한 형광체는 스토크스 시프트가 크고 방출 수명이 최대 밀리초입니다.
TR-FRET은 란타나이드와 단수명 형광체 사이에 근접했을 때 발생하는 공명 에너지 전달에 의존합니다. 이러한 특성으로 인해 표준 FRET에 비해 안정성과 특이성이 향상되었습니다. 버퍼 또는 중간 간섭은 수명이 긴 형광과 도너와 억셉터의 두 방출 파장의 비율 측정 검출에 의해 현저히 감소합니다.
이 기술이 적용되는 일반적인 원리는 여러 키트 제조업체에서 매우 유사하며, 가장 널리 사용되는 키트에는HTRF®, LANCE®,LanthaScreenTM 및 THUNDERTM가 있습니다. 도너와 수용체는 상호 작용하는 파트너에 공유 결합되거나 두 표적(또는 태그)에 대한 특정 항체가 도너 또는 수용체 중 하나로 라벨링되어 있습니다. 도너를 여기시키면 에너지가 수용체로 전달되고, 표적이 가까이 있으면 형광 공명 에너지 전달로 인해 발광합니다. 출력은 일어나는 결합의 양에 비례합니다.
TR-FRET 기술
TR-FRET에서는 제조업체에 따라 서로 다른 쌍을 형성하는 서로 다른 형광 형광체가 사용됩니다.
- 기증 란타나이드는 유로퓸 또는 테르븀입니다(그림 2). 유로퓸과 테르븀 이온은 형광성이 약하기 때문에 빛을 방출하려면 빛을 모으는 '케이지'에 넣어야 합니다. 킬레이트와 크립트레이트는 이러한 목적으로 사용되며, 에너지 수집과 전달을 모두 가능하게 합니다. 테르븀은 유로븀에 비해 양자 수율이 10~20배 증가하고 분자의 흡광도와 관련된 몰 소멸 계수가 더 높습니다. 두 가지 특징 모두 스크리닝 성능을 향상시킵니다.3 킬레이트/크립테이트-란타나이드 복합체는광범위한 화학 조건에서 매우 안정적이며 기존 형광체처럼 광표백을 받지 않는 것으로 알려져 있습니다.
- 수용체는 녹색과 적색 범위에서 발광하는 기존 형광체입니다. 공명 에너지 전달을 위해 적색 형광체는 유로퓸 또는 테르븀과 결합할 수 있지만, 녹색 형광체는 일반적으로 테르븀과 결합합니다.
TR-FRET 감지
란타나이드는 일반적으로 320~340nm에서 여기됩니다. 유로늄의 방출은 일반적으로 620nm에서 감지되는 반면, 테르븀은 키트와 제조업체에 따라 490 또는 620nm에서 감지할 수 있습니다. 수용체의 경우, 방출량은 녹색 형광체의 경우 520nm, 빨간색 형광체의 경우 665nm입니다. 기증자의 방출은 내부 참조로 사용되며, 수용체 방출은 에너지 전달(결합 이벤트)이 일어나고 있음을 나타내는 지표입니다(그림 3).
여기와 형광 검출 사이에는 마이크로초 범위의 시간 지연이 적용됩니다. 이렇게 하면 비특이적인 단시간 배경 형광이 제거됩니다. 그런 다음 일반적으로 마이크로초의 시간(측정 창)에 걸쳐 방출이 감지됩니다(그림 4). 키트 및 제조업체에 따라 시간 지연 및 측정 창 설정이 다를 수 있습니다.
그런 다음 두 방출 채널의 시간 경과에 따른 통합 신호의 비율을 계산합니다. 이 비율 측정은 신호를 정규화하고, 매체 간섭 및 담금질을 제거하며, 액체 취급 오류 또는 웰 간 변동성을 보정합니다.
TR-FRET의 장점
민감도와 다용도성 덕분에 TR-FRET 분석은 널리 사용되고 있습니다. 시간 분해 검출과 비율 측정의 조합은 분석 창을 크게 늘리고 배경을 줄입니다. 또한 란타나이드 방출은 표백이 거의 일어나지 않고 시간이 지나도 안정적이며 다양한 시약 및 실험 조건과 호환됩니다.
이러한 장점에도 불구하고 이 방법의 가장 큰 장점은 결합된 쌍을 검출할 때 배경을 줄이기 위해 결합되지 않은 성분을 물리적으로 분리할 필요가 없다는 점일 것입니다. 소위 균질 분석법이라 불리는 TR-FRET은 중간 세척 단계가 필요 없고 간단한 추가 및 판독 분석법으로 실행할 수 있어(그림 5) 취급 단계를 최소화하고ELISA보다 더 편리하고 시간도 적게 소요됩니다. 따라서 자동화된HTS 스크리닝 캠페인에특히 적합합니다.
그러나 라이브러리 화합물이나 생물학적 단백질의 분자 내 여기 과정 또는 형광과 외부 상호작용으로 인해 발생하는 신호 소멸은 한계가 될 수 있습니다.3
다양한 TR-FRET 키트
TR-FRET 분석 키트는 여러 제조업체에서 제공합니다. 모든 분석은 공통 기술을 기반으로 하며마이크로플레이트 판독기에서 모두 검출할 수 있지만 키트와 제조업체마다 차이가 있습니다. 이는 주로 다양한 기증자 및 수용체 유형, 이들의 조합, 검출 시작 및 측정 기간에 대한 다양한 타이밍과 관련이 있습니다.
- HTRF: 균일시간 분해 형광은서로 다른 쌍을 형성하는 네 가지 특정 형광체를 사용하는 기술입니다. 란타나이드는 유로피움 또는 테르븀 크립테이트입니다. 수용체는 홍조류에서 정제된 색소를 기반으로 하는 1세대 XL665와 XL665와 유사하지만 크기가 더 작은 2세대 d2 등 붉은색 범위에서 방출됩니다. 두 가지 형광체 모두 크립테이트와 결합할 수 있습니다. 또한 테르븀은 녹색 형광체와 결합할 수 있어 잠재적인 멀티플렉싱이 가능합니다(그림 6).
- LANCE: 란타나이드 킬레이트 익사이트는 유로피움 킬레이트와 두 가지 수용체 분자, Surelight® APC및 ULight™에 기반한 TR-FRET 기술입니다. 후자는 분자량이 더 작은(800달톤 미만) 2세대 개선 형광체입니다.
- 란타스크린: 원래 유로퓸과 알로피코시아닌(APC) 또는 알렉사 플루오르647을 기반으로 한란타스크린은 결국 테르븀과 플루오레세인 또는 GFP를사용하도록 최적화되었습니다. 테르븀을 사용하면 유연성이 향상될 것으로 예상됩니다. APC는 일반적으로 스트렙타비딘 접합체로 사용되는데, 이는 분자량이 크기 때문이며(>100 kDa) 3분자 복합체에서 비오티닐화된 기질에 결합되어 있습니다. 테르븀과 함께 플루오레세인 및 GFP를 사용하면 기질에 직접 표지하여 유로퓸-APC 입체 벌크 문제를 극복할 수 있습니다. 또한 GFP를 사용하면 살아있는 세포에서도 GFP 융합 단백질에 기반한 분석이 가능합니다.
- Transcreener® TR-FRET분석: 일반적인 생물학적 효소 반응의 부산물인 ADP, AMP/GMP, UDP 및 GDP를 검출합니다. 각 뉴클레오타이드에 대해 경쟁력 있는 TR-FRET 면역 분석법을 사용할 수 있습니다. 이들의 정량화는 뉴클레오티드 의존성 효소의 효소 활성을 분석하는 데 사용됩니다.트랜스크리너 분석은 항체가 테르븀 킬레이트에, 뉴클레오타이드가 적색 형광물질에 결합하는 경쟁적 설정을 사용합니다. "네이티브" ADP, AMP/GMP, UDP 및 GDP에 의한 추적자의 변위는 공명 에너지 전달을 방지합니다. 따라서 신호의 감소로 표적 분자의 존재를 인식할 수 있습니다.
- THUNDER TR-FRET: 향상된 스펙트럼 호환성과 TR-FRET 신호를 보여주는 FRET 쌍에 기반한 기술입니다. THUNDER 분석은 수명이 길고 매우 안정적인 유로피움 킬레이트를 공여체로 사용하고, 수용체는 원적색 범위에서 방출되는 저분자량 형광체를 사용합니다.5
여기 및 방출 피크를 포함한 모든 분석 기술과 그 특징은 표 1에 요약되어 있습니다. 요약된 특성 외에도 이러한 키트는 간격 시간과 분석 기간도 다양합니다.
표 1: 가장 많이 사용되는 TR-FRET 분석 키트와 여기 및 방출 피크 비교
| 키트 | 기증자 | 케이지 유형 | 여기 | 방출 | 수용체 | 방출 |
| LANCE | 유로피움 | 킬레이트 | 320nm | 620 nm | ULightTM | 665nm |
| LANCE | 유로피움 | Chelate | 320nm | 620 nm | Surelight® APC | 665nm |
| 란타스크린 Eu | Europium | Chelate | 320nm | 620 nm | 알렉사플루오르 647 | 665nm |
| 란타스크린 Tb | Terbium | Chelate | 340nm | 490nm | 플루오레세인/GFP | 520 nm |
| HTRF 레드(Eu) | 유로피움 | Cryptate | 320 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665nm |
| HTRF 레드(Tb) | Terbium | Cryptate | 340 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665nm |
| HTRF 녹색(Tb) | Terbium | Cryptate | 340 nm | 620 nm | 플루오레세인/GFP | 520 nm |
| 트랜스크리너 TR-FRET | Terbium | 킬레이트 | 340nm | 620 nm | HiLyte647 | 665 nm |
| 썬더 | 유로피움 | 킬레이트 | 320nm | 620nm | 원적색 염료 | 665nm |
상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하는 것 외에도 도너 방출 스펙트럼이 억셉터의 여기 스펙트럼과 충분히 겹치는 한 TR-FRET 도너 및 억셉터 쌍을 자유롭게 조합할 수 있습니다( AN 388 참조): 9-테트라하이드로칸나비놀 유도체와 1형 칸나비노이드 수용체(CB1)의 차등 결합.
TR-FRET 마이크로플레이트 판독기
시간 분해능 FRET 검출은 주로 마이크로플레이트판독기에서 수행됩니다. TR-FRET 플레이트 판독기의 기본 설정은 광원, 파장 선택을 위한 여기 및 방출 필터, 광증배관(PMT) 검출기로 구성됩니다. 또한 TRF 감지 모드에서 플레이트 리더기는 한 번의 실행으로 두 개의 방출 채널을 순차적으로 또는 동시에 측정할 수 있어야 합니다. TR-FRET은 주로 고처리량 스크리닝에 사용되므로 일반적으로 384웰 및 1536웰 마이크로플레이트와의 호환성이 필수입니다.
광원
킬레이트 또는 크립테이트 복합체는 일반적으로 320~340nm에서 여기됩니다. 따라서 광원으로 제논 플래시 램프 또는 특정 여기 레이저를 모두 사용할 수 있습니다.TRF 레이저는 이 특정 파장 범위에 더 많은 에너지를 집중시키고 낮은 신호와 높은 신호를 더 잘 구분하여 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.
PHERAstar FSX에는 60 헤르츠 플래시 주파수의 TRF 레이저가 장착되어 있어 TR-FRET 감지에 상당한 속도 이점을 제공합니다. 이 레이저를 사용하면 애플리케이션 노트 "1536웰 마이크로플레이트에서 측정된 세포 및 생화학 HTRF분석"에서 볼 수 있듯이 세포 및 생화학 분석에서 Z´ > 0.8을 유지하면서 전체 1536웰 플레이트를 36초 만에 측정할 수 있습니다(그림 7).
애플리케이션 노트PHERAstar FSX에서 수행된 THUNDER™ TR-FRET 세포 기반 사이토카인 분석의 탁월한 분석 성능에서는 TRF 레이저가 장착된 PHERAstar FSX가 경쟁사 HTS 마이크로 플레이트 리더보다 훨씬 높은 감도와 동적 범위를 나타내는 방법을 보여 줍니다.
전용 검출기
PHERAstar FSX에는 TR-FRET 감지를 위한 광자 카운팅 검출기(PMT)가 장착되어 있습니다. 일반 검출기는 적분 시간 동안 곡선 아래 영역에 대한 적분 값을 출력으로 제공합니다. 광자 계수 PMT는 대신 각 개별 광자를 계수하여 전체 란타나이드 감쇠 곡선을 모니터링합니다.
PHERAstar FSX 리더기에서 광자 계수 감지를 통해 2마이크로초의 시간 분해능으로 방출 감쇠 곡선을 측정하고 표시할 수 있습니다. 감쇠 곡선모니터링이라는 이 고유한 기능은 분석 개발을 간소화하고 타이밍 매개변수를 최적화하여 검출을 개선하고 배경을 줄이는 데 도움이 됩니다. 감쇠 곡선 모니터링은 통합 마법사와 함께 TR-FRET 분석 최적화를 위한 플랫폼을 제공합니다.
듀얼 채널 감지
두 방출 파장을 순차적으로 또는 동시에 감지해야 합니다. 일반적으로 마이크로플레이트 판독기는 두 방출을 차례로 측정합니다. 그러나 동시 감지는 몇 가지 장점이 있습니다.
PHERAstarFSX의동시 이중 방출(SDE) 감지 시스템은 두 개의 방출 파장을 병렬로 측정하기 위해 두 개의 일치하는 PMT를 사용합니다 . 이러한 방식으로 SDE는 판독 시간을 절반으로 줄이고 처리량을 늘리는 동시에 주입량 차이, 농도 또는 여기 에너지의 변동으로 인한 변동을 보정합니다. 이러한 기능 덕분에 감도가 향상되고 %CV가 낮아집니다. 두 방출 채널의 결과 비율을 계산하기 위해 SDE 단일 채널 측정값을 결합합니다.
TR-FRET 분석 소형화
약물 스크리닝에서 분석 소형화는 핵심 단계입니다. 소형화는 재현성, 신뢰성 및 분석 견고성을 유지하면서 샘플 부피를 줄이는 것을 목표로 합니다. 분석은 3456웰 플레이트(384웰 및 1536웰 형식이 가장 일반적이지만)로 다운스케일링할 수 있습니다.
신호 강도는 추적자의 양이 아니라 농도에 따라 달라지기 때문에 정확성과 재현성을 유지하면서 TR-FRET 분석을 소형화할 수 있습니다. 이는 PHERAstarFSX와 같은 고감도 플레이트 리더를 사용함으로써 더욱 뒷받침됩니다.
과학 강연 "스크리닝 분석의 성공적인 다운스케일링: Servier의 경험"에서는 PHERAstarFSX 플레이트 리더기가 384-웰 형식에서 1536-웰 형식으로 HTRF 분석의 소형화에 크게 기여한 사례 연구를 소개합니다. PHERAstarFSX에서 소형화는 시약의 추가 희석과 "즉석" 검출(웰당 단 한 번의 플래시)과 결합되었습니다. 그 결과 고품질의Z´ 값을 얻을 수 있었고 시약 사용량과 시간 소비가 크게 감소했습니다.
키나아제 활성 분석
키나아제 활성은 주로 기질의 인산화 변화를 측정하는 샌드위치 분석법으로 분석하며, 애플리케이션 노트THUNDER™ TR-FRET 세포 키나아제 면역분석을 통한 ERK1/2, p38αβγ 및 STAT3 인산화 분석 에 나와 있는 것처럼 분석할 수 있습니다. 반응에 의해 생성되는 다양한 생성물(예: ADP)을 모니터링하기 위해 경쟁 분석도 사용할 수 있습니다. 또는 애플리케이션 노트 "LanthaScreen TR-FRET 티로신 키나제 및 단백질 키나제 C 분석"에 표시된 것처럼 형광 표지된 키나제 기질과 란타나이드 표지 항-인산화 항체를 사용합니다(그림 8). 이러한 방법은 프로테아제 및 유비퀴틴화에도 적용할 수 있습니다. 키나아제 활성 검출에 대한 자세한 내용은 블로그 게시물 "키나아제 분석"을 참조하세요.
GPCR
G단백질 결합 수용체(GPCR)를 연구하기 위한 분석은 기계적 또는 기능적 분석이 가능합니다 . 기능적 분석은 특정 억제제의 활성으로 인해 세포에 축적될 수 있으므로 주로 이차 전달체 정량화(예: IP1 또는 cAMP)에 중점을 둡니다. 따라서 2차 메신저는 농도가 리간드 결합 및 수용체 결합과 상관관계가 있기 때문에 판독값으로 사용됩니다. 이는 애플리케이션 노트 "기능 스크리닝에 사용되는 HTRF IP-One 분석" 및 "Cisbio의 cAMP 및 IP1 HTRF HTplex 세포 기반 분석을 사용하여 GPCR 활성화 측정"에 나와 있습니다. 메커니즘 분석은 세포막의 수용체 조직과 올리고머화를 통해 신호를 매개하는 데 중점을 둡니다.
바이오마커
다운스트림 신호 생성물의 분석은 신경계, 대사 및 염증성 질환에서 역할을 할 수 있는 비정상적인 경로를 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 시간 분해 FRET은 이러한 질병을 표적으로 하는 화합물의 효능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 응용 사례로는 대사성 질환, 특히 당뇨병을 위한 '신속한 HTRF 인슐린 분석법 개발',신경 퇴행성 질환의'인간 타우 단백질 응집 검출', 다양한 질환의 사이토카인 정량을 위해 PHERAstar FSX에서 수행된 THUNDER™ TR-FRET 세포 기반 사이토카인 분석의 우수한 분석 성능 등이 있습니다.
과학 강연에서는 새로운 비만 치료제를 선별하기 위해 제1형 콜레시스토키닌 수용체를 타겟팅하는 방법에서 IP3의 하류 대사산물인 이노시톨 모노포스페이트의 축적을 선별하기 위해 TR-FRET 분석법을 사용한 방법에 대해 설명합니다. 이러한 결과를 바탕으로 TR-FRET 기반 결합 분석법이 추가로 개발되었습니다.
동역학적 결합 이벤트 분석
기술적 어려움과 상대적으로 낮은 처리량으로 인해 리간드-수용체 결합의 동역학은 전통적으로 신약 개발의 늦은 시점에 연구되어 왔습니다. 그러나콘과코프 속도는 효율성, 부작용 발생, 효능 및 작용 기간에 영향을 미치기 때문에 이를 최적화하면 신약 개발에 큰 도움이 될 수 있습니다. 또한 결합 동역학은 편향된 작용 작용에 중요한 역할을 하는 것으로 보입니다. 따라서 생체 내 모델과 임상 연구로 넘어가기 전에 약물 후보물질의 결합 동역학을 조기에 스크리닝하는 것이 바람직합니다.
결합 동역학 연구(그림 9)는 과학 강연 "리간드-수용체 결합의 동역학 측정 및 단편 스크리닝의 적용을위한 TR-FRET접근법"과 애플리케이션 노트 "HTRF로 결합 동역학 분석"에서 설명한 대로 스크리닝 목적 및 저친화성 화합물의 동역학 연구를 위한 TR-FRET 동적 검출이 가능한 플레이트 리더에서 효율적으로 수행될 수 있습니다.
