PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
O que é o AlphaScreen?
O AlphaScreen® ( ALPHA para Ensaio Homogêneo de Proximidade Luminescente Amplificada) é uma química baseada em esferas usada para estudar as interações entre moléculas em uma microplaca. Originalmente desenvolvida como uma metodologia para ensaios diagnósticos chamada LOCI® ( Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay) em 19941, hoje a tecnologia AlphaScreen (Alpha Technology) inclui o AlphaScreen, o AlphaLISA® e o AlphaPlexTM. Ela é usada principalmente nas ciências biológicas para fins de triagem.
O princípio fundamental da tecnologia AlphaScreen baseia-se na ligação de duas moléculas diferentes de interesse a esferas específicas. Em caso de interação entre as duas moléculas e a proximidade resultante dos dois grânulos, ocorre uma transferência de energia de um grânulo para o outro. Isso resulta na produção de um sinal quimioluminescente. A tecnologia AlphaScreen é usada principalmente em ensaios de triagem de alto rendimento para avaliar interações biomoleculares, a formação/depleção de um substrato ou produto, modificações pós-traducionais e para quantificar analitos.
Além dos ensaios de interação (incluindo ligante/receptor, proteína/proteína, proteína/DNA), a tecnologia AlphaScreen também pode ser aplicada a ensaios funcionais de GPCR (detecção de segundo mensageiro), ensaios enzimáticos e imunoensaios.
Tecnologia AlphaScreen
Os ensaios AlphaScreen baseiam-se em dois tipos de beads revestidos com hidrogel, chamados de beads doadores e aceitadores. Os dois tipos de beads contêm produtos químicos diferentes que são essenciais para a geração do sinal luminoso. A esfera doadora contém um fotossensibilizador que, ao ser excitado pela luz a 680 nm, converte o oxigênio (O2) em uma forma excitante, o oxigênio singlete(1O2). As moléculas de oxigênio simples têm uma vida útil reduzida (meia-vida de 4 microssegundos) e podem se difundir aproximadamente 200 nm em solução antes de voltar ao estado fundamental.
Na ausência de esferas aceitadoras, as moléculas de oxigênio singlete voltam ao estado fundamental sem produzir nenhum sinal de luz. Caso um grânulo aceitador esteja dentro de 200 nm, a energia é transferida dos oxigênios singletos para o grânulo, resultando na produção de luz. As esferas aceitadoras do AlphaScreen contêm três corantes químicos, tioxeno, antraceno e rubreno. As moléculas de oxigênio singlete reagem inicialmente com o tioxeno para gerar luz. Isso é transferido para o antraceno e para o rubreno e resulta em uma ampla emissão de luz de 520 nm a 620 nm.2 A meia-vida da reação de decaimento do sinal é de 0,3 segundos.
Nos ensaios de ligação, um parceiro de ligação (por exemplo, um receptor) é ligado ao doador, enquanto o outro (por exemplo, um ligante) é ligado às esferas do aceitador. Quando o receptor e o ligante interagem, a energia química é transferida de um tipo de grânulo para o outro e um sinal luminoso é produzido (fig. 1). O AlphaScreen também pode ser usado para ensaios de competição ou clivagem. Nesses casos, é medida uma redução na intensidade do sinal.
As esferas doadoras estão normalmente disponíveis como conjugados de estreptavidina, explorando a ligação específica da biotina à estreptavidina para marcar biomoléculas. Em vez disso, as esferas aceitadoras são principalmente conjugadas a anticorpos. Portanto, o segundo parceiro de ligação geralmente requer a presença de um antígeno correspondente para ser ligado (fig. 2). Como alternativa, os dois tipos de beads podem ser revestidos diretamente com os parceiros de ligação por meio de aminação redutiva.
Como os dois tipos de beads têm cerca de 250 nm de diâmetro, eles são muito pequenos para sedimentar em tampões biológicos. Além disso, elas não obstruem as pontas ou os injetores e podem ser facilmente gerenciadas por equipamentos automatizados de manuseio de líquidos. No entanto, são grandes o suficiente para serem filtrados ou centrifugados. O revestimento de hidrogel permite a conjugação de biomoléculas às esferas, reduzindo a ligação não específica e a autoagregação.
AlphaLISA
O AlphaLISA é um desenvolvimento adicional da tecnologia AlphaScreen que se baseia nos mesmos beads doadores, mas usa um tipo diferente de beads aceitadores. Nas esferas AlphaLISA, o antraceno e o rubreno são substituídos por quelatos de európio. O európio excitado emite luz a 615 nm com uma largura de banda de comprimento de onda muito mais estreita do que a do AlphaScreen (fig. 3). Portanto, a emissão do AlphaLISA é menos suscetível à interferência de compostos e pode ser empregada para a detecção de analitos em amostras biológicas, como sobrenadantes de cultura de células, lisados de células, soro e plasma.
O AlphaLISA permite a quantificação de proteínas secretadas, intracelulares ou de membrana celular. Para a detecção de biomarcadores, o AlphaLISA é empregado principalmente como um imunoensaio sanduíche. Um anticorpo anti-analito biotinilado se liga ao grânulo doador de estreptavidina, enquanto um segundo anticorpo anti-analito é conjugado aos grânulos aceitadores do AlphaLISA. Na presença do analito, as esferas ficam muito próximas. A excitação das esferas doadoras libera moléculas de oxigênio singlete que transferem energia para as esferas aceitadoras com emissão de luz a 615 nm (fig. 4). Como alternativa, os imunoensaios de competição também podem ser adaptados.
Em comparação com os ELISAs clássicos, diz-se que o AlphaLISA oferece melhor sensibilidade, uma faixa dinâmica mais ampla e desempenho robusto com tempos de ensaio reduzidos. Além disso, como não exige etapas de lavagem (veja abaixo), é facilmente adaptável à triagem automatizada de alto rendimento.
AlphaPLEX
O AlphaPlex é um desenvolvimento adicional que permite a quantificação de até três analitos em um único poço usando diferentes beads de aceitação que emitem em comprimentos de onda distintos. Nessas esferas, o antraceno e o rubreno são substituídos por quelatos de térbio (para AlphaPlex 545) ou quelatos de samário (para AlphaPlex 645). Os anticorpos anti-analito biotinilados se ligam às esferas doadoras de estreptavidina. Na presença dos analitos-alvo, a excitação das esferas doadoras e a consequente liberação de oxigênio singlete acionam a emissão de luz quimioluminescente das diferentes esferas aceitadoras.
Cada tipo de bead emite luz em um comprimento de onda diferente. Além de 615 nm para as esferas AlphaLISA, os outros picos de emissão estão em 545 nm para as esferas de térbio e em 645 nm para as esferas de samário (fig. 5). Dessa forma, o desenvolvimento de ensaios triplex é possibilitado pelo uso de beads aceitadores AlphaLISA, AlphaPlex 545 e AlphaPlex 645 em um único ensaio.2
Como o AlphaScreen é detectado?
A medição da química do AlphaScreen é realizada predominantemente em leitores de microplacas. Como se trata de um modo de leitura independente, a detecção do ensaio requer um leitor de microplacas com o modo de detecção AlphaScreen. Isso inclui recursos de detecção para AlphaLISA e AlphaPlex também. Como essa tecnologia é frequentemente usada na triagem de medicamentos de alto rendimento, os leitores de placas devem ser compatíveis com placas de 384 e 1536 poços.
A configuração básica do leitor de placas AlphaScreen consiste em uma fonte de luz, filtros de excitação e emissão para seleção de comprimento de onda e um detector de tubo fotomultiplicador (PMT).
Fonte de luz: lâmpada de xenônio ou laser
Como o fotossensibilizador nas esferas doadoras é especificamente excitado a 680 nm, uma lâmpada de xenônio ou um laser de excitação específico são usados como fonte de luz. Um laser AlphaScreen dedicado concentra mais energia em 680 nm, superando o desempenho das lâmpadas de xenônio e levando a melhores resultados com uma faixa dinâmica mais ampla e maior relação sinal-ruído.
Os lasers de excitação AlphaScreen dedicados estão normalmente disponíveis em leitores de microplacas multimodo de alta qualidade e dedicados a HTS, como o PHERAstarFSX e o CLARIOstarPlus. Os leitores econômicos geralmente são equipados com uma lâmpada de flash de xenônio para a detecção do AlphaScreen.
O AlphaPLEX envolve a detecção de diferentes comprimentos de onda de emissão. Embora eles possam ser medidos sequencialmente, a detecção simultânea de duas emissões garante a qualidade dos dados e vantagens de velocidade, especialmente para ensaios de triagem. Dessa forma,a detecção simultânea de dupla emissão ajuda a aumentar o rendimento com ensaios AlphaLISA-AlphaPlex de dupla emissão.
Redução do cross-talk
Ocross-talk é a luz de qualquer poço que não seja o medido, que é medida de forma não específica pelo detector e afeta negativamente o sinal do poço medido.
Como a luz produzida em um poço por uma reação AlphaScreen é difusa, ela pode se espalhar para os poços vizinhos e diretamente para o local de detecção, mesmo que outro poço seja medido. Isso leva a sinais tendenciosos, maiores variações de sinal e menor sensibilidade geral.
Os sinais de luz indesejados chegam ao detector pela parte superior da placa e/ou pela parede dos poços e precisam ser tratados de forma diferente (fig. 6).
- Bloqueio físico: as aberturas são acessórios pretos em forma de colher com um orifício. Quando posicionadas em um poço específico, elas bloqueiam fisicamente a luz indesejada que transborda dos poços vizinhos (fig. 6). Através do orifício, a luz do poço de interesse chega ao detector, enquanto a luz proveniente de seu entorno é fisicamente bloqueada.
- Redução matemática do cross-talk: a luz pode atravessar a parede plástica de um poço, mesmo em microplacas brancas e opacas. As placas de densidade mais alta (por exemplo, 1536 poços) são mais suscetíveis ao vazamento de luz devido à proximidade dos poços e de suas paredes mais finas. Além disso, os poços quadrados adjacentes têm uma conversa cruzada através da parede maior do que os redondos devido às paredes compartilhadas. Além disso, a cor da placa influencia a comunicação cruzada através das paredes da microplaca: quanto mais escura a placa, menor a comunicação cruzada. Se não for possível otimizar ainda mais a placa, uma redução matemática do cross-talk pode ser aplicada aos dados adquiridos. Para isso, o sangramento do sinal para os poços vizinhos é determinado e um algoritmo corrige os dados luminescentes.
Ambas as ferramentas de redução de cross-talk estão disponíveis nas leitoras de placas BMG LABTECH PHERAstar FSX e CLARIOstar Plus.
Leitores de placas AlphaScreen
A detecção AlphaScreen/AlphaLISA pode ser realizada na PHERAstar FSX ena CLARIOstarPlus. Como uma fonte de excitação de alta intensidade é benéfica para o ensaio, o CLARIOstar e o PHERAstarFSX têm lasers dedicados de estado sólido que produzem luz de alta intensidade a 680 nm. Além disso, o PHERAstarFSX oferece módulos ópticos AlphaPlex específicos que permitem a medição simultânea de dois sinais alfa.
Vantagens da tecnologia AlphaScreen
O AlphaScreen fornece uma plataforma homogênea, sensível e de baixo escalonamento que é especificamente adequada para aplicações de triagem de alto rendimento.
Alta relação entre sinal e fundo
O processo de geração de sinal é uma reação em cascata que produz uma alta amplificação de sinal. Isso resulta em alta sensibilidade. Além disso, o fundo é baixo. Isso é consequência principalmente do fato de o comprimento de onda de excitação estar na faixa vermelha e em um comprimento de onda maior do que o sinal de emissão. Isso reduz a autofluorescência gerada por componentes biomoleculares que geralmente são excitados na faixa azul-verde. Além disso, o atraso de tempo entre a excitação e a emissão elimina ainda mais o ruído autofluorescente.
Ensaio homogêneo
A química do AlphaScreen é homogênea: a detecção do complexo de esferas doador-aceitador ligado não requer separação física dos componentes não ligados para reduzir o fundo. Consequentemente, não precisa de etapas de separação ou lavagem intermediárias e pode ser executada com um protocolo simples de adição e leitura. Isso minimiza as etapas de manuseio e o torna mais conveniente e menos demorado do que outros métodos. Portanto, ele é particularmente adequado para fins de triagem com suporte de automação. Esse é um dos motivos de sua grande adoção na descoberta de medicamentos e HTS.
Diminuição de escala e miniaturização
Devido à sua alta sensibilidade e baixo nível de fundo, o AlphaScreen é facilmente adaptável a placas de 1536 poços e pode ser facilmente reduzido a poucos µl sem alteração na concentração do reagente ou na robustez do ensaio, conforme mostrado na nota de aplicação "Miniaturização de um ensaio AlphaLISA de TNF-α baseado em células".
Armadilhas na detecção da tecnologia AlphaScreen
Microplaca e manuseio adequados
As microplacas brancas são mais adequadas para medições AlphaScreen, pois refletem o sinal de luz. As placas pretas absorvem a luz e reduzem o sinal e o fundo. As placas cinzas oferecem maior fidelidade entre a redução da interferência e a reflexão do sinal. Informações detalhadas sobre a escolha da placa podem ser encontradas em nossa postagem no blog: "A microplaca: utilidade na prática".
Como as placas brancas têm uma fosforescência intrínseca, elas emitem luz se expostas ao sol ou à luz ambiente. Esse sinal inespecífico é medido pelo leitor juntamente com a luz emitida pela amostra e resulta em um aumento de espaços em branco e de fundo, além de uma janela de ensaio reduzida. Portanto, recomenda-se preparar as placas brancas no escuro ou deixá-las no escuro por aproximadamente 15 minutos antes da medição.
Iluminação do ambiente
A química do AlphaScreen é sensível à luz. Idealmente, ela deve ser preparada e executada sob condições de luz fraca (menos de 100 Lux). Como isso nem sempre é possível, uma sala fechada deve ser equipada com iluminação verde filtrada. As luminárias próximas ao espaço de trabalho e/ou ao leitor de placas devem ser cobertas com filtros verdes. Foi demonstrado que o uso de filtros verdes é quase tão eficaz quanto a execução do ensaio no escuro (fig. 7).
As placas a serem incubadas por períodos prolongados devem ser protegidas da luz - cobertas com um pano escuro, papel alumínio ou uma caixa de papelão. Evite expor a microplaca ou o leitor de placas ao sol direto ou à luz intensa.
Temperatura ambiente
A química do AlphaScreen é sensível à temperatura. Dessa forma, devem ser evitadas flutuações drásticas na temperatura ambiente, pois elas afetam negativamente a geração, a intensidade e a estabilidade do sinal. Normalmente, a variação do sinal do AlphaScreen é de cerca de 8% por °C.3
Para evitar gradientes de intensidade de sinal na placa durante a leitura, os reagentes e as microplacas também devem ser equilibrados com a temperatura ambiente. No caso das placas, isso pode ser feito facilmente incubando-as em uma incubadora THERMOstar. O PHERAstar FSX com sistema AAS permite até mesmo ajustar ativamente a leitora para qualquer temperatura entre 18° e 45°C e, assim, resfriar a câmara de incubação do dispositivo até a temperatura ambiente ou abaixo dela. Nesta nota de aplicação, é demonstrada a capacidade do sistema AAS de manter uma temperatura estável, reduzir a evaporação e o tempo de resfriamento de temperaturas altas para baixas.
Meios de cultura celular e soros
Os meios de cultura de células, como RPMI 1640, MEM e DMEM, afetam negativamente a intensidade do sinal. A presença de um meio de cultura a 10% resulta em cerca de 30% de atenuação do sinal. Da mesma forma, 10% de soro fetal de bezerro reduz o sinal em cerca de 25%.3 Portanto, recomenda-se enxaguar as amostras de células com um tampão apropriado, como PBS, antes de aplicar a química do AlphaScreen.
Ensaios AlphaScreen
A tecnologia AlphaScreen pode ser aplicada para analisar eventos bioquímicos ou de ligação em formatos de placas de 96, 384 e 1536 poços para diferentes configurações biológicas. A tecnologia é particularmente difundida na comunidade de triagem de medicamentos.
O AlphaScreen é aplicado em diferentes ensaios, como ensaios funcionais de GPCR(cAMP, IP3 e fosfo-ERK1/2), ensaios enzimáticos(tirosina quinase, helicase, protease, fosfatase), ensaios de interação (ensaios de ligação de citocinas, ensaios funcionais de receptores nucleares, ensaios de ligação ligante-receptor, proteína/proteína, proteína/DNA,proteína/peptídeo), imunoensaios do tipo ELISA para quantificação de analitos(TNF-α,IgG).
Ensaio de ligação: interação proteína-peptídeo e identificação de inibidores
Na nota de aplicaçãoPHERAstar mede o ensaio AlphaScreen para desenvolver inibidores seletivos para os domínios YEATS humanos, mostramos um exemplo de um ensaio de interação baseado no AlphaScreen.
Os domínios YEATS são reguladores epigenéticos. O ENL, que contém YEATS, foi confirmado como um dos principais condutores de vários tipos de leucemia aguda. Portanto, o ENL é um alvo para a descoberta de medicamentos. Para fazer a triagem de inibidores seletivos, um ensaio de ligação entre a histona 3 (H3) e o domínio YEATS foi estabelecido usando o kit de detecção de histidina AlphaScreen. O cordão doador é acoplado via estreptavidina à H3 acilada e o cordão aceitador ao domínio YEATS. Quando a proteína e o peptídeo interagem, as diferentes esferas são reunidas e um sinal AlphaScreen é gerado (fig. 8). Os inibidores reduzem o sinal de emissão ao interromper a interação H3-YEATS.
Imunoensaio: detecção de fosfo-ERK1/2
Além da interação, os imunoensaios também podem ser implementados. As respostas de muitos GPCRs não são facilmente medidas nos formatos de ensaio atuais. A cascata de fosforilação ERK resulta na fosforilação de proteínas citoplasmáticas e nucleares que regulam a transcrição de genes. Por isso, ela pode ser usada para rastrear alterações celulares induzidas pelo envolvimento com GPCR.
Para essa finalidade, o ensaio de fosforilação ERK1/2 AlphaScreen SureFire® foi usado em lisados de células. Esse é um imunoensaio em sanduíche. Uma proteína celular fosforilada é colocada em um sanduíche entre um anticorpo anti-analito associado a um cordão doador revestido com estreptavidina e um anticorpo antifosfo associado a um cordão aceitador conjugado com proteína A (fig. 9). A fosforilação da substância a ser analisada resulta em um aumento do sinal de luz. Isso é mostrado na nota de aplicação do ensaio An AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2.
Referências
- Imunoensaio de canalização de oxigênio luminescente: Medição da cinética de ligação de partículas por quimioluminescência. Ullman, EF, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, pp. 5426-5430, junho de 1994.
- Yasgar A, Jadhav A, Simeonov A, Coussens NP. Ensaios baseados no AlphaScreen: Ultra-High-Throughput Screening for Small-Molecule Inhibitors of Challenging Enzymes and Protein-Protein Interactions (Triagem de rendimento ultra-alto para inibidores de moléculas pequenas de enzimas desafiadoras e interações proteína-proteína). Methods Mol Biol. 2016;1439:77-98. doi:10.1007/978-1-4939-3673-1_5
- https://www.urmc.rochester.edu/MediaLibraries/URMCMedia/hts/documents/AlphaScreenPracticalGuide.pdf
AlphaScreen, AlphaLISA, AlphaPlex e SureFire® são marcas registradas da PerkinElmer.
