PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
Was ist Lumineszenz?
Das Wort Lumineszenz setzt sich zusammen aus "lumin" (lateinisch für Licht) und dem Suffix "-escence" (für Prozesse oder Veränderungen). Es handelt sich also um einen Prozess, bei dem Licht freigesetzt wird. Laut Definition stammt die Lumineszenz aus kalten Quellen und wird von der Emission aus erhitzten Quellen (Glühen) wie heißem Eisen oder einer brennenden Kerze unterschieden1. Leuchtsignale können bei der Energieumwandlung aus einer breiten Palette von Energiequellen entstehen. Der Prozess wandelt unsichtbare Energie in sichtbare Strahlung um und kann in der Natur als Abwehrmechanismus, für LEDs auf Bildschirmen oder zu Analysezwecken genutzt werden. Der Inhalt dieser Seite konzentriert sich auf die Verwendung von Lumineszenzmethoden in den Biowissenschaften, erklärt ihren physikalischen Hintergrund, liefert Informationen über ihren Nachweis auf Lumineszenz-Mikroplattenlesegeräten und stellt gängige Lumineszenz-Mikroplattenassays vor. Elektrolumineszenz, Radiolumineszenz und Thermolumineszenz sind nicht Teil dieses Inhalts, da sie für dieses Thema nicht relevant sind.
Physikalischer Hintergrund der Lumineszenz
Lumineszenz ist die Erzeugung eines Leuchtsignals durch Energieumwandlung. Ihre Anwendung in den Biowissenschaften stützt sich in erster Linie auf zwei Energiequellen: chemische oder Lichtenergie, die zu Chemo- bzw. Photolumineszenz führt. Letztere ist auch die Grundlage der Fluoreszenz (Phosphoreszenz).
Die Energie einer der beiden Quellen wird von einem Molekül absorbiert und bringt seine Elektronen auf ein höheres Energieniveau (Abb. 1). Da dieses Niveau instabil ist, fallen die Elektronen aus dem angeregten Zustand in den Grundzustand zurück. Beim Zurückfallen geben die Elektronen Energie in Form von Schwingungsenergie, Wärme und Photonen ab. Letzteres ist die Lumineszenzemission2.
In den Biowissenschaften wird der Begriff "Fluoreszenz" üblicherweise verwendet, wenn von Phosphoreszenz oder Photolumineszenz die Rede ist, während sich "Lumineszenz" in der Regel auf Chemilumineszenz bezieht. Diese Vereinfachung wird durch den Unterschied in der Detektion unterstützt: Fluoreszenz erfordert eine Anregungsquelle, Lumineszenz dagegen nicht (Abb. 2). Dieser Inhalt hält sich an diese gängige Nomenklatur und konzentriert sich auf die Chemilumineszenz, die im Folgenden als "Lumineszenz" bezeichnet wird.
Lumineszenz in biowissenschaftlichen Anwendungen
a) Chemilumineszenz
Bei dieser Reaktion reagiert ein Substrat in einem elektronisch angeregten Zustand. Die Elektronen des angeregten Produkts oder Zwischenprodukts fallen in ihren niedrigsten Energiezustand, wobei sie Photonen emittieren und somit lumineszieren. Ein typisches Beispiel ist die Reaktion von Luminol in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (Abb. 3). In einer alkalischen Umgebung liegt dieses Substrat in einer Form (Dianion) vor, die mit molekularem Sauerstoff O2 reagiert. Das oxidierte Zwischenprodukt reagiert dann zu einer elektronisch angeregten 3-Aminophthalsäure (3-APA). Das Molekül fällt dann in den Energiezustand zurück, den es normalerweise einnimmt, und setzt Licht frei. Dieses einfache Prinzip ist auch die Grundlage für die verstärkte Chemi- und Biolumineszenz. Es handelt sich also ebenfalls um chemilumineszente Reaktionen.
b) Verstärkte Chemilumineszenz (ECL)
ECL verwendet Verstärker für die Chemilumineszenzreaktion. Bei ECL wird hauptsächlich Luminol in Verbindung mit Wasserstoffperoxid verwendet. Die Oxidation wird jedoch durch ein Enzym katalysiert: Meerrettichperoxidase (HRP). Zusätzlich enthalten ECL-Reaktionen Chemikalien, die die Lichterzeugung verstärken, wie p-Cumarsäure oder 4-Jodphenylboronsäure. Die Verwendung eines Enzyms zur Katalyse der chemischen Reaktion ermöglicht den Einsatz von ECL in enzymverknüpften Reaktionen. Seine Hauptanwendung sind Immunoblots: Proteine werden nach Größe getrennt, auf eine Membran übertragen und mit ECL nachgewiesen. Die auf der Membran immobilisierten Proteine von Interesse werden durch einen proteinspezifischen Antikörper gebunden. Ein zweiter, an Meerrettichperoxidase gekoppelter Antikörper wird verwendet, um den Protein-Antikörper mit dem Enzym zu verbinden. Dank der Enzyme und Verstärker wird nur dort ein helles Signal erzeugt, wo das Protein zu finden ist.
Das gleiche Prinzip wird für die Quantifizierung von Biomolekülen auf Mikroplatten verwendet. ELISA-Tests mit Lumineszenzanzeige haben eine höhere Empfindlichkeit und basieren auf ECL. Das interessierende Protein wird auf der Mikroplattenvertiefung immobilisiert, und spezifische Antikörper, HRP-gekoppelte Sekundärantikörper, Substrat und Verstärker erzeugen ein Leuchtsignal, das mit der Proteinkonzentration zunimmt.
c) Biolumineszenz
Biolumineszenz tritt in lebenden Organismen auf. Der Begriff umfasst auch Reaktionen, bei denen Enzyme und Substrate verwendet werden, die ursprünglich aus lebenden Organismen stammen, jedoch außerhalb des Organismus verwendet werden oder durch Bioengineering verbesserte Eigenschaften erhalten. Die Biolumineszenz wird für verschiedene biologische Zwecke genutzt. Glühwürmchen nutzen ihre Fähigkeit zu leuchten, um Partnerinnen anzulocken. Man nimmt an, dass Quallen wie Aequorea victoria oder Tiefseegarnelen die Lichterzeugung nutzen, um biologische Feinde abzuwehren. Beim Quorum Sensing erzeugen Bakterien wie der marine Vibrio fischeri ein Leuchtsignal, wenn sie eine bestimmte Dichte erreichen. Dies ermöglicht es der Population, zu kommunizieren und sich zu koordinieren.
Wie schaffen es diese Organismen, zu leuchten? Durch ein Enzym (Luciferase), das die Oxidation von Substraten (Luciferinen) katalysiert und dabei Photonen freisetzt. Verschiedene Organismen verwenden unterschiedliche Enzyme und Substrate. Außerdem sind für die lichtemittierenden Reaktionen unterschiedliche Kofaktoren erforderlich, was zu unterschiedlichen Wellenlängen führt. Abbildung 4 zeigt drei Reaktionen weit verbreiteter Luciferasen in biowissenschaftlichen Versuchen.
d) Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET)
Der Resonanzenergietransfer beschreibt die Übertragung von Energie von einem elektronisch angeregten Donor-Molekül auf ein Akzeptor-Fluorophor. Der Prozess regt das Akzeptor-Fluorophor an, das seinerseits Photonen emittiert. Wenn die Donorenergie durch Biolumineszenz erzeugt wird, nennt man den Prozess Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET). Um den Transfer zu ermöglichen, müssen verschiedene Bedingungen erfüllt sein: Das Emissionsspektrum des Donor-Moleküls muss sich mit dem Anregungsspektrum des Akzeptor-Fluorophors überschneiden. Außerdem müssen sich Donor und Akzeptor in unmittelbarer Nähe befinden (typischerweise 1-10 nm), da die Übertragung mit der Entfernung abnimmt. Daher wird die BRET üblicherweise zur Messung der Wechselwirkung zweier Biomoleküle verwendet. Das Ergebnis der BRET ist die Intensität des Akzeptor-Fluorophors im Verhältnis zur Intensität des Donors, bekannt als BRET-Verhältnis. BRET1, BRET2 und NanoBRET verwenden unterschiedliche Kombinationen von Enzymen und Akzeptor-Fluorophoren (siehe Tabelle 1).
Tabelle 1 - Arten von BRET
| Bezeichnung | Spender-Luciferase | Substrat | Donor-Emission | Akzeptor-Fluorophor | Akzeptor-Emission |
| BRET 1 |
Renilla |
Coelenterazin |
450-500 nm |
YFP | 515-560 nm |
| GFP |
510-540 nm | ||||
| BRET 2 | Renilla | DeepBlueC | 400-450 nm | GFP | 500-540 nm |
| NanoBRET | NanoLuc | Furimazin | 420-500 nm | NanoBRET 618 | 550-675 nm |
| TMR | 550-600 nm | ||||
| AlexaFluor 633 | 600-700 nm | ||||
| Venus | 515-575 nm |
e) Blitzlumineszenz
Lumineszenz-basierte Assays für biowissenschaftliche Anwendungen verwenden entweder Flash- oder Glow-Reaktionen. Der Unterschied zwischen den beiden besteht in der Dauer des Signals. Flash-Assays erzeugen ein Signal für maximal ein paar Sekunden. Die Intensität des erzeugten Lichtblitzes wird in der Regel direkt vom Beginn bis zum Ende der Reaktion aufgezeichnet. Dies bedeutet, dass Flash-Reaktionen durch die Zugabe eines Reaktionsstarters gestartet werden müssen. Bei Mikroplatten-Readern werdenReagenzieninjektoren benötigt, um die Reaktion automatisch zu starten und gleichzeitig das Signal aufzuzeichnen. Beliebte Flash-Lumineszenz-Assays sind dieDual-Luciferase Reporter™-TechnologieoderSPARCL-Assays.
f) Glüh-Lumineszenz
Im Gegensatz zur Flash-Lumineszenz erzeugt die Glow-Lumineszenz stabile Signale für bis zu Stunden. Die Assays erfordern keine automatische Dosierung und können über einen längeren Zeitraum abgelesen werden. Sowohl Forscher als auch Anbieter von Kits bevorzugen Glow-Assays, da sie einfacher zu handhaben und nachzuweisen sind. Einer der bekanntesten Vertreter der Glow-Lumineszenz ist der Lebensfähigkeitstest CellTiterGlo®.
Wie wird die Lumineszenz nachgewiesen?
Abgesehen von der ECL-Detektion in Western Blots werden Lumineszenztests typischerweise in Mikroplatten (6 bis 1536-Well-Formate) durchgeführt und mit einem Mikroplatten-Lesegerät quantifiziert. In diesem Abschnitt wird erläutert, wie die Lumineszenz in Mikroplatten gemessen wird.
Komponenten für die Lumineszenzdetektion
Lumineszenz ist einfacher zu erkennen als Fluoreszenz oder Absorption, da keine Anregung erforderlich ist. Das bedeutet, dass weder eine Lichtquelle noch eine Auswahl der Anregungswellenlänge erforderlich sind. Die minimal erforderlichen Komponenten sind eine Linse zum Sammeln des Lichtsignals und ein Detektor (Abb. 5). Für die Messung der BRET ist ein Wellenlängenauswahltool erforderlich, und für spezielle Detektionskonstruktionen können Lichtleiter notwendig sein.
a) Photomultiplier-Röhre (PMT)
Photomultiplier-Röhren (PMTs) dienen als Detektoren bei der Lumineszenz-Detektion. PMTs unterscheiden sich durch ihre Empfindlichkeit (das niedrigste nachweisbare Signal), ihr Rauschen und ihre Fähigkeit, andere Detektionsarten zu messen. Viele Messgeräte sind mit einem universellen PMT ausgestattet, der sowohl Lumineszenz als auch andere Detektionsmodi messen kann. Ihre Vorteile sind ein geringer Platz- und Kostenbedarf bei hoher Empfindlichkeit. Die Möglichkeit, sehr niedrige Signale zu messen, wird durch optimierte optische Systeme geboten. Ein solches optimiertes System ist der optische Freiluftpfad in Kombination mit einem Lumineszenz-plus-Optikmodul, das in den PHERAstar FSX-Mikroplattenlesegeräten zu finden ist.
Dedizierte PMTs für die Lumineszenzdetektion bieten entweder ein geringeres Rauschen oder die Verwendung eines Photonenzählungsprinzips. Während beide dedizierten PMTs auch niedrige Signale erkennen können, ist ein Photonenzählsystem bei der Erkennung höherer Signale eingeschränkt (Abb. 6).
b) Lichtleiter
Im Idealfall befindet sich der Detektor direkt über der Vertiefung. Wenn dies nicht möglich ist, muss das Lichtsignal von der Vertiefung zum Detektor geleitet werden. Diese Aufgabe kann entweder durch Linsen und Spiegel oder durch einen Lichtleiter erfüllt werden. Der Lichtleiter absorbiert einen Teil der Lumineszenz, wodurch sich die Empfindlichkeit im Vergleich zu einem optischen Pfad in freier Luft verringert. Letzteres ist bei denMikroplatten-Lesegeräten VANTAstar, CLARIOstar Plusund PHERAstar FSXzu finden.
c) Auswahl der Wellenlänge
Bei einigen Anwendungen ist es für optimale Ergebnisse erforderlich, nur bei einer bestimmten Wellenlänge zu detektieren. Dies wird durch optische Filter oder Monochromatoren erreicht, die in den optischen Pfad eingesetzt werden. BRET-Messungen erfordern eine Auswahl der Wellenlänge, da zwei Signale von ein und derselben Probe stammen. Um zwischen dem vom Donor- und dem vom Akzeptor-Fluorophor stammenden Licht zu unterscheiden, werden zwei Filter benötigt.
Herkömmliche Monochromatoren auf Gitterbasis spielen bei der gefilterten Lumineszenz und der BRET-Messung aufgrund ihrer begrenzten Empfindlichkeit eine untergeordnete Rolle. Dies ist auf Streueffekte und enge Bandbreiten zurückzuführen. Eine Monochromatortechnologie mit linearen variablen Filtern (LVF) bietetjedoch die erforderliche Empfindlichkeit. Ein LVF-basierter Monochromator weist eine filterähnliche Transmission auf und bietet Bandbreiten von bis zu 100 nm. Dadurch wird sichergestellt, dass genügend Signal den Detektor für gefilterte Lumineszenz wie BRET erreicht (Abb. 7).
Messzeitintervall, Integrationszeit oder Erfassungszeit
Ein Lumineszenzsignal dauert eine Sekunde oder länger und unterscheidet sich daher deutlich von Fluoreszenz, die in Nanosekunden abklingt. Dementsprechend wird das Signal typischerweise über einen Zeitraum zwischen 0,1 und 1 Sekunde erfasst. Diese Zeit hat verschiedene Bezeichnungen: Messzeit, Integrationszeit und Messintervallzeit. Sie hängt von mehreren Aspekten ab, die gegeneinander abgewogen werden müssen, z. B. von der Signalintensität und der Gesamtzeit für das Ablesen einer Platte.
Tipps, Tricks und Überlegungen für Lumineszenzmessungen
Die Lumineszenzmessung in Mikroplatten-Readern ist relativ einfach, da sie in der Regel nur wenige Einstellungen erfordert. Allerdings gibt es gerätebezogene und allgemeine Variablen, die sich auf die Messungen und die Datenqualität auswirken.
Integrationszeit
Wie bereits erwähnt, hängt die Erfassungszeit von mehreren Faktoren ab. Die folgenden Aspekte sollten bei der Wahl der Integrationszeit berücksichtigt werden:
a) Signalintensität
Die meisten Assays emittieren so viel Licht, dass ein Signal in einer halben bis 0,02 Sekunden erfasst werden kann. Nur sehr selten ist es notwendig, die Integrationszeit auf einige Sekunden zu erhöhen, um Unterschiede in den Lumineszenzsignalen zu erkennen.
b) Blitz- und Glimmlumineszenz
Glühsignale werden in der Regel 0,1 bis 1 Sekunde lang erfasst, da sie ein stabiles Signal aussenden. Daher spielen die gesamte Plattenlesezeit sowie der Zeitpunkt und die Dauer der Signalmessung eine untergeordnete Rolle. Dies ist bei Flash-Assays anders. Hier ist es wichtig, das gesamte Emissionssignal von Anfang bis Ende zu erfassen, was je nach Assay mehrere Sekunden dauern kann.
Wenn es wichtig ist, zu wissen, wie die Signalkurve aussieht und wie hoch die maximale Emission einer Flash-Reaktion ist, sind mehrere Messungen bei sehr niedrigen Integrationszeiten erforderlich. Wenn eine Reaktion beispielsweise etwa eine Sekunde dauert, können 50 Messungen von 0,02 s durchgeführt werden, um eine Sekunde abzudecken und zu beobachten, wie sich das Signal entwickelt und abklingt.
c) Zeitliche Auflösung
Dieser Punkt ist nur für kinetische Messungen von Bedeutung. Wenn eine zellbasierte oder biochemische Reaktion mit einem Lumineszenztest überwacht wird, bestimmt der zeitliche Verlauf der Reaktion die Integrationszeit. Bei Calcium-Assays beispielsweise treten Reaktionen in einem Bereich von 20 Sekunden nach der Stimulation auf und können durch 10 Messungen alle 2 Sekunden angezeigt werden. Wenn nur eine Vertiefung gemessen wird, kann eine Integrationszeit von 1 oder 2 s gewählt werden, was zu einer angemessenen zeitlichen Auflösung führt. Müssen jedoch mehrere Vertiefungen mit der gleichen zeitlichen Auflösung (Messpunkt für jede Vertiefung alle 2 Sekunden) gemessen werden, muss die Integrationszeit verringert werden, um die verbleibenden Vertiefungen zu messen und Datenverluste zu vermeiden.
d) Gesamte Lesezeit
Da die Integrationszeit auf jede Vertiefung angewendet wird, trägt sie wesentlich zur Gesamtlesezeit einer Platte bei. Erhöht man die Integrationszeit für jede Vertiefung um nur 0,2 s, erhöht sich die Gesamtlesezeit einer vollen 96-Well-Platte um 20 s, bei einer 384-Well-Platte um mehr als eine Minute. Daher ist es wichtig, bei Platten mit hoher Dichte (384- oder 1536-Well-Platten) und bei Anwendungen mit hohem Durchsatz, bei denen Tausende von Platten an einem Tag gemessen werden müssen, niedrige Integrationszeiten zu verwenden.
Verstärkung
Die Verstärkung kann als ein Verstärkungsfaktor betrachtet werden, der ein festes Dynamikfenster entlang der Konzentrationskurve der Probe verschiebt. Niedrige Signalintensitäten erfordern höhere Verstärkungen, während intensive Signale niedrigere Verstärkungen erfordern. In der Regel wird die Verstärkung so eingestellt, dass die maximale Messleistung bei der Probe mit der erwarteten höchsten Intensität erreicht wird. Dies geschieht, um ein möglichst großes dynamisches Fenster zwischen dem höchsten und dem niedrigsten Messwert zu erhalten. Wenn also positive Kontrollen mit einem maximalen Signal zusammen mit unbekannten Proben verwendet werden, kann die Verstärkung an diesen angepasst werden.
Die Möglichkeit, mit unterschiedlichen Verstärkungen zu messen, was zu einem großen dynamischen Bereich führt, ermöglicht die Messung sehr niedriger Signale und heller Emissionen mit nur einem Gerät.
Verstärkungseinstellungen sind nicht für alle Lumineszenz-Mikroplattenlesegeräte erforderlich und hängen vom Detektor und der Automatisierung des Verstärkungseinstellungsprozesses ab.
ModerneLumineszenz-Plattenlesegeräte führen die Gain-Einstellung automatischdurch. Dies nimmt dem Forscher nicht nur diese Verantwortung ab, sondern gewährleistet auch einen breiten dynamischen Bereich. Solche Geräte sind der CLARIOstar® Plusund der VANTAstar® mitseinerEnhanced Dynamic Range Technologie.
Plattenfarbe für Lumineszenzmessungen
Weiße Platten eignen sich am besten für Lumineszenzmessungen, da sie das Signal reflektieren, anstatt es zu absorbieren. Weitere Details zur Plattenwahl finden Sie in unserem Blogbeitrag:"Die Mikroplatte: Nutzen in der Praxis".
Wichtig ist, dass eine schwarze Platte bevorzugt wird, wenn ein Lumineszenz- und ein Fluoreszenz-Assay in derselben Vertiefung kombiniert werden. Die Messung der Fluoreszenz in einer weißen Platte führt zu sehr instabilen Werten und einem sehr hohen Hintergrundsignal aufgrund der Reflexion des Anregungslichts. Dies macht den Fluoreszenznachweis in weißen Platten recht problematisch. Die Messung der Lumineszenz in schwarzen Platten verkleinert das Assay-Fenster. Da jedoch der Hintergrund stark reduziert ist und die Messungen geringere Abweichungen aufweisen, sollten die Messungen dennoch zufriedenstellende Ergebnisse liefern.
Was ist Übersprechen und wie kann es umgangen werden?
AlsÜbersprechen bezeichnet man das Licht aus einer anderen als der gemessenen Vertiefung, das vom Detektor unspezifisch gemessen wird und das Signal der tatsächlich gemessenen Vertiefung verändert. Es ist ein Phänomen, das nur die Lumineszenzdetektion betrifft.
Da das bei einer Lumineszenzreaktion erzeugte Licht diffus ist, kann es nicht nur direkt über der Vertiefung leuchten, sondern auch in benachbarte Vertiefungen und direkt zum Ort der Detektion streuen, auch wenn eine andere Vertiefung gemessen wird. Dies führt zu verzerrten Signalen, höheren Schwankungen und einer geringeren Gesamtempfindlichkeit. Das Problem kann je nach Reaktionstyp und Streuung des Signals auf unterschiedliche Weise gelöst werden.
Bei Flash-Assays, die nur wenige Sekunden lang leuchten, genügt es, die Platte in einer anderen Reihenfolge zu messen. Da das Signal schnell abklingt, sind die einzigen Vertiefungen, die vom Übersprechen betroffen sind, die benachbarten, wenn sie direkt nacheinander gemessen werden. Wird eine entfernte statt einer benachbarten Vertiefung gemessen, wird das Übersprechen drastisch verringert, da das abklingende Signal an der entfernten Stelle nicht mehr nachweisbar ist. Zu diesem Zweck bieten die BMG LABTECH Mikroplatten-Lesegeräte einen Zeilensprung-Modus. In diesem Modus wird jede zweite Vertiefung gemessen, bis das Ende der Platte erreicht ist. Dann werden die ausgelassenen Zonen gemessen. So können die zuerst gemessenen Signale abklingen, bis ihre direkten Nachbarn gemessen werden.
Glühtests geben über Stunden hinweg stabile Signale ab und erfordern andere Strategien, um Übersprechen zu vermeiden. Unerwünschte Signale können auf zwei Wegen zum Nachweisort gelangen: über die Platte und durch die Wand der Vertiefungen (Abb. 8). Beide Wege müssen unterschiedlich angegangen werden.
a) Physikalische Blockierung
Blenden blockieren physisch das unerwünschte Licht, das über die Wells in den Detektor scheint. Eine Blende ist ein schwarzes löffelförmiges Zubehörteil mit einem Loch darin, das über der Mikroplatte angebracht wird (Abb. 8). Durch das Loch gelangt das Signal des interessierenden Wells zum Detektor, während das gesamte Licht aus der Umgebung physikalisch blockiert wird. BMG LABTECHs Multimode-Mikroplatten-Reader PHERAstar®FSX sowie VANTAstar® und CLARIOstar® Plus sindmit Blenden für eine verbesserte Lumineszenzdetektion ausgestattet.
b) Reduzierung des mathematischen Übersprechens
Selbst in weißen Mikrotiterplatten kann Licht durch die Kunststoffwand eines Wells scheinen. Die Art der Mikrotiterplatte hat einen erheblichen Einfluss auf das Übersprechen, das durch die Wände einer Platte scheint. Im Allgemeinen weisen Platten mit höherer Dichte (z. B. 1536 Vertiefungen) einen höheren Lichtdurchlass durch die Wände auf als Platten mit geringerer Dichte, da die Wände dünner sind. Ein zweiter Aspekt ist die Vertiefungsgeometrie: quadratische Vertiefungen weisen ein höheres Übersprechen durch die Wand auf, da benachbarte Vertiefungen eine gemeinsame Wand haben. Runde Vertiefungen haben keine gemeinsame Wand und weisen daher ein geringeres Übersprechen durch die Wand auf. Außerdem beeinflusst die Farbe der Platte das Übersprechen durch die Mikroplattenwände: je dunkler die Platte, desto geringer das Übersprechen. Graue Platten bieten einen Kompromiss zwischen der Reduzierung des Übersprechens und der Signalreflexion.
Wenn es nicht möglich ist, die Platte weiter zu optimieren, kann eine mathematische Nebensprechreduktion auf die gewonnenen Daten angewendet werden. Zu diesem Zweck wird der Signalüberlauf zu benachbarten Vertiefungen bestimmt und ein Algorithmus korrigiert die Daten. Eine automatische Bestimmung und Korrektur des Übersprechens findet sich in den BMG LABTECH Plattenreadern PHERAstar®FSX,VANTAstar® undCLARIOstar®Plus.
Lichtemission von der Platte
Weißplatten haben eine intrinsische Phosphoreszenz: Die Platte selbst emittiert Licht, wenn sie belichtet wird. Dieses Signal kann die Daten verfälschen, indem es die Leerwerte erhöht und das Testfenster verkleinert. Es wird daher empfohlen, die Platte im Dunkeln vorzubereiten oder sie etwa 15 Minuten vor der Messung im Dunkeln zu lassen.
Filterauswahl
Filter werden hauptsächlich für BRET-Messungen benötigt. Da Lumineszenz oft geringe Signalleistungen aufweist, wird empfohlen, Filter mit einer breiten Bandbreite von 80 - 100 nm zu verwenden. Breitere Bandbreiten führen dazu, dass mehr Licht zum Detektor durchdringt, und erhöhen die Empfindlichkeit der Messung.
Lumineszenz-Assays - Wofür wird die Lumineszenz-Detektion verwendet?
Reporter-Assays
Bei Reporter-Assays werden genregulatorische Sequenzen in Kombination mit der genetischen Information eines Reportermoleküls verwendet, um entweder Veränderungen in der Genexpression oder Veränderungen in der regulatorischen Region selbst zu untersuchen. Die genetische Information des Reportergens muss in die Zellen eingebracht werden. Wenn das Reportergen aktiv ist, wird das Enzym transkribiert und übersetzt. In Anwesenheit eines Substrats wird es umgewandelt, es entsteht Licht, dessen Emission über die Aktivität der regulatorischen Sequenzen Auskunft gibt.
Dual-Luciferase-Reporter-Assay
DieDual-Luciferase-Reporter-Assays (DLR™) fügen dem System einen zweiten Reporter hinzu. Neben dem Reporter, der an die gewünschte regulatorische Sequenz gekoppelt ist, dient eine zweite Luciferase, die von einem "Housekeeping"-Promotor gesteuert wird, als interne Kontrolle. Mit dem CLARIOstar oder dem VANTAstar und ihrer Lumineszenz-Scanning-Option ist es möglich, passende Luziferasen zu identifizieren und z. B. bis zu sechs Luziferasen in einem einzigen Multiplex-Luziferase-Assay zu kombinieren.
Zellviabilität
Der am weitesten verbreitete Lebensfähigkeitstest basiert auf dem Firefly-Enzym. Seine Aktivität nimmt mit steigendem ATP-Gehalt zu und damit auch die Lichtemission. Lebensfähige Zellen produzieren ATP, das nach der Zelllyse die Reaktion antreibt. Dementsprechend korreliert die Emission mit der Zellzahl und der Lebensfähigkeit. Zusätzlich zu den ATP-basierten Endpunkt-Lebensfähigkeitstests können Lumineszenztests die Zelllebensfähigkeit in Echtzeit messen. Zu diesem Zweck werden der Zellkultur ein Pro-Substrat sowie das Firefly-Enzym zugesetzt. Das Pro-Substrat wird nur von lebensfähigen Zellen reduziert und dann in einer lichtemittierenden Reaktion verarbeitet. Auf diese Weise gibt die Lumineszenz in Echtzeit Auskunft über Veränderungen der Lebensfähigkeit. Mehr über diese Assays erfahren Sie in unserem wissenschaftlichen Vortrag "Real-time cell health assays deliver better data with less effort". Zelllebensfähigkeitstests sind auch für die Arbeit mit PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) und molekularen Klebstoffen beim gezielten Proteinabbau für die Arzneimittelforschung von Bedeutung. Dazu gehört auch die Forschung im Bereich des gezielten Proteinabbaus, der sich aus spezifischen Wechselwirkungen zwischen bekannten Degronen und Ligasen ergibt.
Stoffwechsel
Der Zellstoffwechsel umfasst verschiedene Schritte der molekularen Umwandlung. Viele der verfügbaren Assays zum Nachweis zellulärer Stoffwechselvorgänge basieren auf Lumineszenz. Der Grundstoffwechsel konzentriert sich auf die Verwendung von Hauptnährstoffen wie Glukose. Der Glukoseverbrauch kann zum Beispiel mit dem Glukose-Glo-Assay verfolgt werden. Zur indirekten Messung des Glukoseverbrauchs kann auch das Abbauprodukt von Glukose - Laktat - mit dem Laktat-Glo-Assay nachgewiesen werden. Die Leistungsfähigkeit beider Assays wird in der AppNote: Glucose assay and lactate assay allow to monitor cellular glucose metabolism precisely in a cell-based assay demonstriert. In der AppNote: ROS detection in a cell-based format using the Promega ROS-Glo™ assay wird die Verwendung eines lumineszenzbasierten Assays zum Nachweis von übermäßig produzierten reaktiven Sauerstoffspezies gezeigt.
Rezeptorbindung
Rezeptoren sind häufige Zielstrukturen für Arzneimittel und ihre Liganden sind mögliche Therapeutika. Die Bindung von Liganden an ihre Rezeptoren kann in zellbasierten Assays nach dem BRET-Prinzip untersucht werden. Die Luziferase wird am extrazellulären Teil des Rezeptors exprimiert, und ein Ligand wird mit einem geeigneten Akzeptor-Fluorophor markiert. Bindet der Ligand an seinen Rezeptor, sind Donor und Akzeptor nahe genug beieinander, um Energie zu übertragen, und das BRET-Verhältnis steigt. Die Methode ermöglicht auch die Untersuchung der Rezeptorbindung von nicht markierten Verbindungen. Diese können mit einem bekannten Liganden, der mit einem Fluorophor markiert ist, um die Bindung konkurrieren. Wenn das BRET-Verhältnis in einem solchen kompetitiven Aufbau abnimmt, hat eine unmarkierte Verbindung das Akzeptormolekül verdrängt, was zu einem Verlust des Transfers führt (Abb. 9).
Wie diese Assays bei der Untersuchung der Rezeptorpharmakologie helfen, wird in unserem wissenschaftlichen Vortrag "Real-time profiling of receptor pharmacology"erläutert.
