Nephelometer

Ein Nephelometer ist ein zweckgebundenes Gerät zur Messung der Trübung einer Probe.

 

Grundlegende Informationen zu Nephelometern

Ein Nephelometer ist ein zweckgebundenes Gerät zur Messung der Trübung einer Probe. Klassischerweise wird eine Trübung durch unlösliche Partikel in einer Flüssigkeit oder in einem Gas verursacht. Im Gegensatz zur Absorption, wird durch Nephelometer nicht die Abschwächung des transmittierten Lichts, sondern die Lichtstreuung gemessen, also das Licht das von den Partikeln in einer Probe reflektiert wird.

 

Nephelometer Microplate Reader detektieren unlösliche Partikel flüssiger Proben in Mikroplatten. Die Partikeldichte lässt sich als Funktion der Lichtstreuung berechnen. Bei einer gegebenen Partikeldichte, verhält sich die Lichtstreuung bis zu einem gewissen Grad relativ zu spezifischen Eigenschaften der Partikel wie Größe, Farbe und Form.

 

Nephelometer Microplate Reader werden hauptsächlich zur Bestimmung des Trübungsgrades und der Anwesenheit von Partikeln in verschiedenen Bereichen wie z. B. in der Arzneimittelforschung und im Wirkstoff-Screening, in der akademischen Life Science Forschung und zur Überwachung der Wasserqualität eingesetzt. Bei der Qualitätsprüfung von Wasser werden diese Geräte auch als Trübungsmessgeräte bezeichnet.

 

Auf dem Markt besteht eine Vielzahl an Geräten für unterschiedliche Anwendungen. Diese Modelle unterscheiden sich hauptsächlich in der Position und dem Winkel zwischen Lichtquelle und Detektor.
Die Nephelometrie wird auch für die Messung der Lichtstreuung von Aerosolen (z.B. Staubverschmutzungen in der Luft) und die Untersuchung der Atmosphäre von Planeten mit Gasphasennephelometern eingesetzt. Diese Bereiche sind jedoch für die Untersuchung in Microplate Readern nicht relevant.

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Was ist ein Nephelometer?

Ein Nephelometer enthält eine Lichtquelle,  einen optischen Streulichtkollektor, sowie einen Detektor, der rechtwinklig zum Eingangslichtstrahl angeordnet ist. Es handelt sich um zweckgebundene Geräte, die nur als Single-Mode Microplate Reader erhältlich sind.

 

Im NEPHELOstar Plus von BMG LABTECH wird eine Laserdiode (bei 635 nm) mit einem hochkollimierten Laserstrahl, als hochintensive Lichtquelle eingesetzt. Der Laserstrahl durchdringt das Probenwell. Sofern in der Probe keine Partikel vorhanden sind, die das Licht streuen, durchdringt der Strahl die Probe geradewegs und es kommt kein Signal zustande. Sind Partikel in der Probe vorhanden, wird das Licht in einen Streulichtkollektor, der sogenannten Ulbricht-Kugel, gestreut. Hierbei wird das Licht im Inneren der Kugel reflektiert und schließlich von einer Fotodiode detektiert.

 

In flüssigen Proben verhält sich die Intensität des gestreuten Lichts über einen weiten Bereich linear zur Konzentration der streuenden Partikel. Basierend hierauf lässt sich das Gerät zur Konzentrationmessung von Partikeln mittels der Detektion von Streulicht einsetzen. Die Konzentration einer Probe ergibt sich also aus der Menge an Licht, die von ihren Partikeln abgelenkt wird. Das Ausmaß des abgelenkten Lichts hängt dabei von der Art (Größe, Farbe, Form, Reflexionsvermögen) der Partikel ab. 

 

Als Einheit der Trübung, wird bei einem kalibrierten Nephelometer oder Trübungsmessgerät,  die Nephelometrische Trübungseinheit (nephelometric turbidity unit, NTU) genutzt. Die Messung des Trübungsgrades mit einem kalibrierten Nephelometer ist jedoch ein zeitaufwändiger und mehrstufiger Prozess, der zudem große Probenmengen erfordert.

 

In der Application Note "Improving throughput for assessing nephelometric turbidity units (NTUs) using the NEPHELOstar Plus" ist dargestellt, wie der Einsatz unseres Nephelometers bei der Erhebung von NTU Daten ein höherer Durchsatz bei gleichzeitiger Vereinfachung des Untersuchungsansatzes mit einem reduzierten Probenvolumen ermöglicht. Daten die am NEPHELOstar Plus als RNUs (Relative Nephelometry Units) erhoben wurden, werden hierbei mit den NTU Ergebnissen eines herkömmlichen Geräts verglichen.

 

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Was gilt es bei der Auswahl eines Nephelometers zu beachten?

Da die Leistung des Gerätes einen wesentlichen Einfluss auf die Qualität der erhobenen wissenschaftlichen Daten haben kann, gibt es der Auswahl eines neuen Nephelometer Microplate Readers verschiedene Faktoren zu beachten.

 

Nephelometrie und Turbidimetrie

Lichtstreuung lässt sich sowohl mittels Nephelometrie als auch mittels Turbidimetrie bestimmen. Obwohl diese beiden Begriffe manchmal synonym verwendet werden, beschreiben sie, wie oben bereits erwähnt, zwei unterschiedliche Technologien. Die Turbidimetrie basiert auf einer Absorptionsmessung und kann auf einem Absorptions-Microplate Reader durchgeführt werden. Die Messung der Nephelometrie ist nur auf einem speziellen Gerät möglich.

 

Bei der Entwicklung einer Streumethode wird die Wahl zwischen Nephelometer und Trübungsmessgerät von zwei Faktoren bestimmt. Die wichtigste Überlegung ist die Empfindlichkeit. Sofern die Probe nur eine geringe Konzentration an streuenden Partikeln enthält, ist ein Nephelometer die beste Wahl. Die Turbidimetrie zeigt hingegen bei Proben mit einer hohen Konzentration an streuenden Partikeln vorteilhaft. Im NEPHELOstar Plus wird das gestreute Licht ausgehend von unlöslichen Partikeln bei Einfallswinkeln von bis zu 80° erfasst. Herkömmliche Absorptionsmessgeräte messen die Reduktion von direktem Licht beim Durchdringen der Probe. Gegenüber diesem Ansatz weisen Nephelometer eine etwa dreißigfach höhere Empfindlichkeit auf.

 

Weiterhin spielt auch die Größe der streuenden Partikel eine wesentliche Rolle. Da die Intensität des Streulichts bei 90° zunimmt, eignen sich Nephelometer im Allgemeinen besser für die Messung kleiner Partikel (< 1 µm). Bei der Trübungsmessung wird die Reduktion des trasnmittierten Lichts gemessen, somit hat die Partikelgröße hier eine kleinere Bedeutung.

 

Flexibilität

Bei einem Nephelometer handelt es sich um ein zweckgebundes Gerät, welches jedoch eine hohe Flexibilität aufweißt. Diese ergibt sich hauptsächlich aus dem Lichtsrahl, der bei  der Messung der Lichtstreuung eine große Rolle spielt. Ein exklusives Merkmal des NEPHELOstar Plus ist die variable Intensität und der regulierbare Strahlendurchmesser der Laserlichtquelle.

 

Durch die Anpassung der Intensität des Laserstrahls, lässt sich die Empfindlichkeit der Messung verbessern und so eine optimale Datenqualität erreichen. Durch den Einsatz eines Laserstrahls mit schmaler Breite, lassen sich Flüssigkeitsoberflächeneffekte, wie z. B. ein starker Meniskus reduzieren. Darüber hinaus ergibt sich so eine bessere Leistung in Mikroplatten mit hoher Well-Dichte bis zu 384 Wells.

 

Abhängig vom eingesetzten Assay, können auch eine präzise Temperaturregelung, die Multi-Mode-Schüttelfunktionen, die Anpassung der internen Atmosphäre oder eine Gasentlüftung von Vorteil sein.


Kompatible Mikroplattenformate

Klassische nephelometrische Assays werden in der Life Science Forschung üblicherweise in 96-Well Mikroplatten analysiert. Der Umstieg auf 384-Well Platten ermöglicht eine deutliche Zeitersparnis bei hohem Probenumfang, sowie eine Kostenreduzierung beim Einsatz teurer Reagenzien.  Da Lichtstreuung auch durch Staub, Schmutz oder Kratzer auf dem Boden eines Wells verursacht werden kann, sollten die für die Nephelometrie verwendeten Mikrotiterplatten mit äußerster Sorgfalt behandelt werden.

 

Reagenzinjektoren

Je nach Art des Assays, den Sie durchführen möchten, kann die Verwendung von Reagenzinjektoren ebenfalls von Vorteil sein. Bei schnelleren Reaktionen findet das zu untersuchende Ereignis  oft unmittelbar nach dem Start der Reaktion statt. Bei der manuellen Zugabe von Reagenzien in die Wells, besteht das Risiko, den relevanten Auswertezeitpunkt zu verpassen und somit wichtige Datenpunkte der Reaktion zu verlieren. 

Unser Nephelometer

Der NEPHELOstar Plus eignet sich zur nephelometriebasierten Detektion und stellt den weltweit einzigen Laser-basierten Nephelometer Microplate Reader dar. Der NEPHELOstar Plus setzt einen spezifischen Laser als Lichtquelle ein, dessen Intensität und Durchmesser sich frei regulieren lassen. Zum Erfassen von Streuchlicht dient im NEPHELOstar Plus eine Ulbricht-Kugel mit einem Winkel von bis zu 80°. Dank dieser Besonderheiten, ist dieses Gerät in der Lage, einfache Turbiditätsmessungen qualitativ zu übertreffen.

 

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Welche Assays lassen sich an einem Nephelometer untersuchen?

Im Bereich Life Science werden Nephelometer hauptsächlich in pharmazeutischen Laboren zur Prüfung der Löslichkeit von Medikamenten und für automatisierte Screenings eingesetzt. In biochemischen Laboren gehören die Protein-Protein-Interaktion, Protein-Aggregation und Polymerisationsstudien zu den Hauptanwendungen. In der Immunologie findet die nephelometrische Detektion hauptsächlich in der Entwicklung neuer Antikörper und der Analyse ihrer Bindungsfähigkeit an Antigene Anwendung.


Durch die Flexibilität und Leistungsfähigkeit des NEPHELOstar Plus lassen sich mehr Anwendungen auf die Mikroplatten-basierte Lasernephelometrie übertragen als je zuvor. Dazu gehören u.a. auch Flockungsassays sowie Wachstumskinetiken von Bakterien und Pilzen.

 

Automatisierte Screenings zur Löslichkeit von Wirkstoffen

Die Bestimmung der Löslichkeit von wässrigen Verbindungen ist zu einem wichtigen und frühen Schritt im Prozess der Wirkstoffentwicklung geworden. Die Löslichkeitsbestimmung lässt sich im Hochdurchsatzverfahren durchführen und soll zeitaufwändige und kostspielige ADME-Screens von schwer löslichen Verbindungen vermeiden. Es hat sich gezeigt, dass durch die Bestimmung über die Lichtstreuung gleichwertige Ergebnisse wie bei der Bestimmung über eine HPLC  erreicht werden können. Diese Ergebnisse werden dabei weitestgehend nicht von gefärbten Lösungen beeinflusst.

 

Mikrobielle Wachstumskinetiken

Durch die kontinuierliche Messung der Veränderung der Lichtstreuung in einer mikrobiellen Suspension, lässt sich mittels Nephelometrie die Wirkung antimikrobieller Medikamente auf mikrobielle Wachstumskinetiken analysieren. Neben verschiedenen anderen Parametern der Wachstumskurven, wirken sich antimikrobielle Medikamente stark auf die Dauer der Lag-Phase aus. Dieses frühe Stadium der Wachstumskurve lässt sich durch den Einsatz des NEPHELOstar PLUS deutlich genauer abbilden als mit herkömmlichen Photometern.

 

Proteinbestimmung

In der klinischen Chemie werden nephelometrische Immuno-Assays zur Bestimmung der Konzentration von Serum-Immunglobulinen (IgA, IgG, lgM), Komplementkomponenten (C3, C4), Akute-Phase-Reaktionsproteinen (CRP, Transferrin), Albumin und Alpha-1-Antitrypsin verwendet. Unter Proteinpräzipitation von globulären Proteinen versteht man die Bildung von Proteinaggregaten durch Zugabe von z. B. Salz oder organischem Lösungsmittel. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Immunpräzipitation die selektive Fällung eines bestimmten Proteins durch eine Antikörper-Antigen-Reaktion.

 

Überwachung von Polymerisationsprozessen

In der organischen Chemie wird die Nephelometrie zur Quantifizierung von Makromolekülen, z. B. bei der Überwachung einer Polymerisationsreaktion, eingesetzt.

Beispiele zu möglichen Messungen mit einem Nephelometer von BMG LABTECH:

Hier finden Sie die vollständige Liste der Application Notes zum Thema Nephelometrie.