Fluorescence Plate Reader

Grundlegende Informationen zu Fluorescence Plate Readern

Was ist ein Fluorescence Plate Reader?

Ein Fluorescence Plate Reader (kurz: Fluorescence Reader) wird auch als Spektrofluorometer oder Fluorometer bezeichnet und beschreibt ein Gerät zur Detektion und Quantifizierung von Lichtphotonen, welche von fluoreszenten Proben in einer Mikroplatte nach Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge emittiert werden.

Fluorescence Plate Reader sind für die Messung der Fluoreszenzintensität und FRET vorgesehen. Die Detektion in anderen Modi wie der Fluoreszenz Polarisation, der zeitaufgelösten Fluoreszenz (TRF) oder zeitaugelöstem FRET lässt sich lediglich mit manchen Single-Mode Fluorescence Plate Readern umsetzen. Dies ist meist nur mit einer geringeren Intensität möglich. Zur Messung in diesen Detektionsmodi, sowie von Absorption und Lumineszenz, werden in der Regel Multi-Mode Microplate Reader benötigt.

Im Gegensatz zur Absorption handelt es sich bei der Fluoreszenzdetektion nicht um eine absolute Messung. Die Intensität des Fluoreszenzsignals wird in der Regel relativ zu anderen Messungen oder Referenzmessungen bestimmt. Fluorescence Plate Reader messen das von einer Probe emittierte Lichtsignal folglich in relativen Fluoreszenzeinheiten (relative fluorescence units, RFU).

Fluorescence Plate Reader kommen für verschiedene Anwendungen in unterschiedlichen Bereichen, wie z. B. in der akademischen Life Science Forschung, bei der Erforschung und dem Screening von Medikamenten, in klinischen Labors, in der synthetischen Biologie und bei der Überwachung der Lebensmittel- oder Wasserqualität zum Einsatz.

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Was gilt es bei der Auswahl eines Fluorescence Plate Readers zu beachten?

Bei der Auswahl eines neuen Fluorescence Plate Readers gibt es einiges zu beachten. Die Leistung des Gerätes kann nämlich einen wesentlichen Einfluss auf die Qualität der wissenschaftlichen Daten haben.

Sensitivität
Fluorescence Plate Reader weisen gegenüber Absorptions-Readern vor allem bei der Quantifizierung eine höhere Sensitivität auf. Unabhängig davon liefern Fluorescence Plate Reader mit einer höheren Sensitivität statistisch hochwertigere Daten mit einer geringeren Varibailität zwischen den Replikaten und einem größeren Delta (Unterschied) zwischen den positiven und negativen Proben. Darüber hinaus ermöglicht die bessere Sensitivität die Reduktion der eingesetzen Proben- und Reagenzienmenge bei gleichbleibend hoher Datenqualität und somit eine Reduktion des Kostenaufwands.

Dynamischer Bereich
Bei der Detektion der Fluoreszenzintentensität, erstreckt sich die Konzentration der Proben oft über einen weiten Bereich. Gleichermaßen können sich die zugehörigen Signale, die am Fluorescence Plate Reader gemessen werden müssen, über einen großen Bereich - von schwach bis sehr hell - erstrecken. Darüber hinaus ist die Signalintensität von Proben enzymatischer oder zellbasierter kinetischer Assays oft schwer vorhersehbar, da sich ihr maximales Signal über einen längeren Zeitraum im Verlauf der Kinetik entwickelt.

In solchen Fällen kann es schwierig sein, alle Signale einer Messung mit nur einer Einstellung zu erfassen. Proben mit hoher Intensität können zur Sättigung des Fluoreszenzdetektors im Microplate Reader führen. Proben mit geringer Intensität lassen sich so gegebenenfalls nicht mehr von den Blanks unterscheiden.

Ein Fluorescence Plate Reader mit einem großen Dynamikbereich ermöglicht es auch Proben von ganz unterschiedlicher Intensität in einem Durchgang zu erfassen. Dadurch lassen sich mehrfache Durchgänge zur Ermittlung des richtigen Verhältnisses von Probenverdünnung und Gain Einstellung und die damit einhergehende Verschwendung von Zeit und Ressourcen vermeiden. Die Funktion "Enhanced Dynamic Range" des CLARIOstar Plus bietet den größtmöglichen Dynamikbereich auf dem Markt (über acht Konzentrationsdekaden) und ermöglicht die automatische Messung sehr intensiver und sehr schwacher Signale in derselben Messung - ohne vorherige Einstellung.

Auswahl der Wellenlängen
Sowohl für die Anregung als auch für die Emission ist in Fluorescence Plate Readern zwingend eine Auswahl der Wellenlängen erforderlich. Dies ermöglicht, unspezifischen Hintergrund und Signalrauschen zu reduzieren, das normalerweise durch Lichtstreuung oder Autofluoreszenz von der Probe oder der Mikroplatte ausgeht.

Hierfür kommen sowohl Filter als auch Monochromatoren zum Einsatz. Filter sind in der Regel empfindlicher, während Monochromatoren mehr Flexibilität bieten. Der CLARIOstar Plus mit seinem Monochromatorsystem das auf linear variablen Filtern (LVF) basiert bildet eine Ausnahme zu dieser Regel und vereint die Vorteile beider Optionen. LVF-Monochromatoren haben eine filterähnliche Leistung und machen den CLARIOstar Plus zum empfindlichsten Monochromator-basierten Microplate Reader auf dem Markt.

Die Möglichkeit zur gleichzeitigen Detektion von zwei Emissionskanälen auf einem Fluorescence Plate Reader zeigt vor allem für die Messung von FRET-Assays viele Vorteile. Diese Option halbiert die Messzeit und reduziert die Variabilität zwischen den Daten. Die gleichzeitige Detektion von zwei Emissionswellenlängen. Simultaneous Dual Emission (SDE)-Erkennung ist beim PHERAstar FSX verfügbar und ist eine Option beim LUMIstar Omega und FLUOstar Omega.

Kompatible Mikroplattenformate
Klassische Fluoreszenz Assays werden in der Life Science Forschung üblicherweise in 96-Well Mikroplatten analysiert. Der Umstieg auf 384- oder 1536-Well Platten ermöglicht eine deutliche Zeitersparnis bei hohem Probenumfang und auch eine Kostenreduzierung beim Einsatz teurer Reagenzien. Vorweg sollte aber auf jeden Fall sicher gestellt werden, dass der Fluorescence Plate Reader Ihrer Wahl auch in der Lage ist, in dem von Ihnen gewünschten Mikroplattenformat zu lesen.

Reagenzinjektoren
Bei der Auswahl eines Fluorescence Plate Readers spielt der gewünschte Assaytyp eine wesentliche Rolle. Bei der Untersuchung enzymatischer Kinetiken oder zellulärer Antworten in Echtzeit ergeben sich klare Vorteile durch den Einsatz von Injektoren zur Zugabe von Reagenzien. Bei schnelleren Reaktion findet das zu untersuchende Ereignis oft unmittelbar nach dem Start der Reaktion statt. Bei der manuellen Zugabe von Reagenzien in die Wells besteht das Risiko, den relevanten Auswertezeitpunkt zu verpassen und somit wichtige Datenpunkte der Reaktion zu verlieren. Unsere mit Injektoren ausgestatteten Fluorescence Plate Reader erlauben die gleichzeitige Injektion und Signaldetektion bevor die Messung im nächsten Well fortgesetzt wird.

Anpassung der internen Atmosphäre
Wenn Sie Assays mit lebenden Zellen über einen längeren Zeitraum durchführen möchten und Ihre Mikroplatte nicht zwischen Fluorescence Plate Reader und Inkubator hin- und her transportieren wollen, sollten Sie darauf achten, dass der Reader Ihrer Wahl die Zusammensetzung der Atmosphäre in seiner Messkammer kontrollieren kann.

Sowohl die Omega-Serie als auch der CLARIOstar Plus lassen sich mit unserer Atmospheric Control Unit (ACU) ausstatten. Mit der ACU lässt sich die ideale Atmosphäre für jede Anwendung mit lebenden Zellen einstellen. Die ACU regelt unabhängig voneinander sowohl den O2- als auch den CO2-Gehalt im Microplate Reader. In Kombination mit der Schüttel- und Temperierfunktion des Readers bietet die ACU eine echte "Walk-away"-Lösung für alle zellbasierten Assays, von Standardbedingungen bis hin zu hypoxischen Untersuchungen.