PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
Qu'est-ce que TR-FRET ?
Le FRET résolu dans le temps (TR-FRET) est une technologie de détection qui combine la fluorescence résolue dans le temps (TRF) et le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET). Le TR-FRET est principalement utilisé pour analyser les événements de liaison et pour le criblage à haut débit de médicaments.
Le transfert d'énergie par résonance de Förster décrit le transfert d'énergie entre deux fluorophores. Il porte le nom du scientifique allemand Theodor Förster, qui a développé la théorie du transfert d'énergie par résonance.
Pour qu'il ait lieu, un fluorophore donneur, qui a absorbé de l'énergie lors de l'excitation et se trouve dans un état électroniquement excité, transfère de l'énergie à un second fluorophore accepteur. Ce transfert d'énergie réduit l'intensité d'émission du donneur tout en augmentant celle de l'accepteur.
Le transfert d'énergie dépend de deux conditions : Premièrement, la proximité spatiale entre le donneur et l'accepteur doit se situer entre 20 et 90 Å. Le transfert d'énergie par résonance est inversement proportionnel à la sixième puissance de la distance entre le donneur et l'accepteur ; il est donc très sensible aux changements de distance. Deuxièmement, un chevauchement entre le spectre d'émission du donneur et le spectre d'excitation de l'accepteur est nécessaire. Les « paires FRET » nécessitent une distance suffisante entre les pics d'émission pour pouvoir être distinguées optiquement, mais aussi un chevauchement spectral suffisant pour permettre un transfert d'énergie efficace (voir la figure 1A).
En biologie, les protéines fluorescentes codées génétiquement sont les plus couramment utilisées. Les plus populaires sont la protéine fluorescente verte (GFP), la protéine fluorescente rouge (RFP), la protéine fluorescente cyan (CFP) et la protéine fluorescente jaune (YFP).2
Le FRET est généralement utilisé pour étudier les interactions moléculaires ou les événements de liaison et peut être employé pour déterminer l'affinité de liaison de deux partenaires. Il permet d'étudier les interactions moléculaires ou les événements de liaison, et de déterminer l'affinité de liaison de deux partenaires. Elle consiste à lier chaque partenaire de liaison à étudier à un fluorophore, puis à détecter le niveau de transfert d'énergie qui a lieu (voir la figure 1 B et C). Cependant, étant donné que la FRET standard est affectée par le bruit de fond provenant de la lumière d'excitation diffusée et de l'autofluorescence, il est difficile d'obtenir des mesures très sensibles avec cette approche.
Principe du TR-FRET
La FRET résolue dans le temps élimine le bruit de fond de courte durée, issu de la diffusion de la lumière d'excitation et de l'autofluorescence, grâce à l'utilisation de la fluorescence résolue dans le temps et à l'introduction d'une détection retardée dans le temps. Cela est possible grâce à l'utilisation de lanthanides en tant que donneurs. Ces fluorophores présentent de grands décalages de Stokes et des durées de vie d'émission pouvant atteindre plusieurs millisecondes.
Le TR-FRET repose sur le transfert d'énergie par résonance entre un lanthanide et un fluorophore à courte durée de vie, lorsqu'ils sont proches l'un de l'autre. Grâce à ces propriétés, la stabilité et la spécificité du TR-FRET sont améliorées par rapport au FRET standard. L'interférence du tampon ou du milieu est considérablement réduite par la fluorescence à longue durée de vie et par la détection ratiométrique des deux longueurs d'onde d'émission du donneur et de l'accepteur.
Le principe général de l'application de cette technologie est très similaire chez les différents fabricants de kits, dont les plus connus sont HTRF®, LANCE®, LanthaScreenTM et THUNDERTM. Le donneur et l'accepteur sont soit liés de manière covalente aux partenaires qui interagissent, soit un anticorps spécifique à chacune des deux cibles (ou étiquettes) est marqué avec le donneur ou l'accepteur. En excitant le donneur, l'énergie est transférée à l'accepteur, qui émet en raison du transfert d'énergie par résonance de fluorescence, si les cibles sont proches. L'intensité de l'émission est proportionnelle à la quantité de liaison qui a lieu.
Technologie TR-FRET
Dans la technologie TR-FRET, le fabricant utilise différents fluorophores formant différentes paires.
- Les lanthanides donneurs sont l'europium ou le terbium (voir la figure 2). Les ions Europium et Terbium étant faiblement fluorescents, ils doivent être intégrés dans une « cage » collectrice de lumière pour émettre de la lumière. Les chélates et les cryptates sont utilisés à cette fin, car ils permettent à la fois de collecter et de transférer l'énergie. Par rapport à l'europium, le terbium présente un rendement quantique 10 à 20 fois supérieur et un coefficient d'extinction molaire plus élevé, ce qui correspond à l'absorbance d'une molécule. Ces deux caractéristiques améliorent les performances de criblage.3 Le complexe chélate/cryptate-lanthanide est censé être extrêmement stable dans une large gamme de conditions chimiques et ne pas être sujet au photoblanchiment, contrairement aux fluorophores conventionnels.
- Les accepteurs sont des fluorophores conventionnels qui émettent dans les gammes verte et rouge. Pour le transfert d'énergie par résonance, les fluorophores rouges sont généralement combinés à l'europium ou au terbium, tandis que les verts le sont avec le terbium.
Détection TR-FRET
Les lanthanides sont généralement excités à 320-340 nm. L'émission de l'europium est généralement détectée à 620 nm, tandis que celle du terbium peut l'être à 490 ou 620 nm, selon le kit et le fabricant. Pour les accepteurs, l'émission est soit de 520 nm pour les fluorophores verts, soit de 665 nm pour les fluorophores rouges. L'émission du donneur est utilisée comme référence interne, tandis que l'émission de l'accepteur sert d'indicateur au transfert d'énergie (événement de liaison) qui a lieu (voir la figure 3).
Un délai de l'ordre de la microseconde est appliqué entre l'excitation et la détection de la fluorescence. Cela permet d'éliminer la fluorescence de fond non spécifique de courte durée. L'émission est ensuite généralement détectée sur une période de temps (fenêtre de mesure) de quelques microsecondes (voir la figure 4). Les réglages du délai et de la fenêtre de mesure peuvent varier en fonction du kit et du fabricant.
Un rapport des signaux intégrés dans le temps des deux canaux d'émission est ensuite calculé. Cette mesure ratiométrique permet de normaliser le signal, d'éliminer l'interférence du milieu et le quenching, ainsi que de corriger les erreurs de manipulation du liquide ou la variabilité d'un puits à l'autre.
Avantages du TR-FRET
Sa sensibilité et sa polyvalence ont largement contribué à la popularité des essais TR-FRET. La combinaison de la détection résolue dans le temps et des mesures ratiométriques élargit considérablement la fenêtre d'essai et réduit le bruit de fond. De plus, l'émission des lanthanides est stable dans le temps, ne blanchit pas et est compatible avec différents réactifs et conditions expérimentales.
Malgré ces avantages, le principal atout de cette méthode est probablement le fait que la détection de la paire liée ne nécessite pas de séparer physiquement les composants non liés afin de réduire le bruit de fond. En tant qu'essai dit homogène, le TR-FRET ne nécessite pas d'étapes de lavage intermédiaires et peut être exécuté comme un simple essai « add-and-read » (voir la figure 5), ce qui le rend plus pratique et moins chronophage que les ELISA. Il est donc particulièrement adapté aux campagnes de criblage HTS automatisées.
Cependant, l'extinction du signal due à des interactions externes avec le processus d'excitation intramoléculaire ou à la fluorescence des composés de la bibliothèque ou des protéines biologiques peut constituer une limitation.3
Différents kits TR-FRET
Les kits d'essai TR-FRET sont disponibles auprès de plusieurs fabricants. Bien que tous les essais soient basés sur une technologie commune et puissent être détectés sur un lecteur de microplaques, il existe des différences entre les kits et les fabricants. Celles-ci sont principalement liées aux différents types de donneurs et d'accepteurs, à leurs combinaisons, ainsi qu'aux moments de début de détection et de mesure.
- La technologie HTRF (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, ou « fluorescence homogène résolue dans le temps ») utilise quatre fluorophores spécifiques formant des paires différentes. Le lanthanide est un cryptate d'europium ou de terbium. Les accepteurs émettent dans le rouge : le XL665 de première génération, basé sur un pigment purifié à partir d'algues rouges, et le D2 de deuxième génération, similaire au XL665 mais plus petit, qui peuvent être combinés avec l'un ou l'autre cryptate. En outre, le terbium peut être combiné à des fluorophores verts, ce qui permet un multiplexage potentiel (voir la figure 6).
- La technologie TR-FRET LANCE (Lanthanide Chelate Excite) est basée sur un chélate d'europium et deux molécules acceptrices différentes : Surelight® APC et ULight™. Ce dernier est un fluorophore de deuxième génération amélioré, avec un poids moléculaire plus faible (inférieur à 800 daltons).
- Initialement basé sur l'europium et l'allophycocyanine (APC) ou l'Alexa Fluor 647, LanthaScreen a finalement été optimisé pour utiliser le terbium et la fluorescéine ou la GFP. L'utilisation du terbium est censée améliorer la flexibilité. L'APC est généralement utilisé comme conjugué de streptavidine en raison de sa grande masse moléculaire (> 100 kDa) et est couplé à un substrat biotinylé dans un complexe tri-moléculaire. En combinaison avec le terbium, la fluorescéine et la GFP peuvent être utilisées pour marquer directement les substrats, ce qui permet de pallier les problèmes d'encombrement stérique de l'europium-APC. L'utilisation de la GFP permet également de réaliser des essais basés sur des protéines de fusion GFP, même dans des cellules vivantes.
- Les tests Transcreener utilisent une configuration compétitive dans laquelle les anticorps sont liés à un chélate de terbium et les nucléotides à un fluorophore rouge. Le déplacement du traceur par l'ADP, l'AMP/GMP, l'UDP ou le GDP « natifs » empêche le transfert d'énergie par résonance. La présence de molécules cibles peut ainsi être détectée par une diminution du signal.
- La technologie THUNDER TR-FRET est basée sur une paire FRET présentant une compatibilité spectrale et un signal TR-FRET améliorés. Les tests THUNDER utilisent un chélate d'europium à longue durée de vie et très stable comme donneur, tandis que l'accepteur est un fluorophore de faible poids moléculaire émettant dans le rouge lointain.5
Toutes les technologies de dosage et leurs caractéristiques, y compris les pics d'excitation et d'émission, sont résumées dans le tableau 1. Outre ces caractéristiques, ces kits varient également en termes de temps d'intervalle et de fenêtres d'essai.
Tableau 1 : comparaison des kits de dosage TR-FRET les plus courants et de leurs pics d'excitation et d'émission
| Kit | Donneur | Type de cage | Excitation | Émission | Accepteur | Émission |
| LANCE | Europium | Chélate | 320 nm | 620 nm | ULightTM | 665 nm |
| LANCE | Europium | Chélate | 320 nm | 620 nm | Surelight® APC | 665 nm |
| LanthaScreen Eu | Europium | Chélate | 320 nm | 620 nm | AlexaFluor 647 | 665 nm |
| LanthaScreen Tb | Terbium | Chélate | 340 nm | 490 nm | Fluorescéine/GFP | 520 nm |
| HTRF rouge (Eu) | Europium | Cryptate | 320 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
| HTRF rouge (Tb) | Terbium | Cryptate | 340 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
| HTRF vert (Tb) | Terbium | Cryptate | 340 nm | 620 nm | Fluorescéine/GFP | 520 nm |
| Transcreener TR-FRET | Terbium | Chélate | 340 nm | 620 nm | HiLyte647 | 665 nm |
| THUNDER | Chélate d' | europium | 320 nm | 620 nm | Colorant rouge lointain | 665 nm |
Outre l'utilisation de kits disponibles dans le commerce, il est également possible de combiner librement des paires de donneurs et d'accepteurs TR-FRET, à condition que le spectre d'émission du donneur présente un chevauchement suffisant avec le spectre d'excitation de l'accepteur, comme le montre l'AN 388 : Liaison différentielle des dérivés du ∆9-tétrahydrocannabinol aux récepteurs cannabinoïdes de type 1 (CB1).
Lecteur de microplaques TR-FRET
La détection FRET résolue dans le temps est principalement réalisée sur des lecteurs de microplaques. La configuration de base d'un tel lecteur comprend une source lumineuse, des filtres d'excitation et d'émission permettant de sélectionner la longueur d'onde, ainsi qu'un détecteur à tube photomultiplicateur (PMT). Outre le mode de détection TRF, les lecteurs de microplaques doivent pouvoir mesurer deux canaux d'émission en une seule fois, de manière séquentielle ou simultanée. Le TR-FRET étant principalement utilisé pour le criblage à haut débit, la compatibilité avec les microplaques de 384 et 1 536 puits est généralement obligatoire.
Sources lumineuses
Les complexes de chélates ou de cryptates sont généralement excités à une longueur d'onde de 320 à 340 nm. Une lampe flash au xénon ou un laser d'excitation spécifique peuvent donc être utilisés comme source lumineuse. Un laser TRF concentre davantage d'énergie sur cette plage de longueurs d'onde spécifique et offre une meilleure discrimination entre les signaux faibles et élevés.
Le PHERAstar FSX est équipé d'un laser TRF dont la fréquence de flash est de 60 Hz, ce qui offre un avantage significatif en termes de vitesse pour la détection TR-FRET. Il permet de mesurer une plaque complète de 1 536 puits en 36 secondes, tout en conservant un Z' > 0,8 pour les essais cellulaires et biochimiques (voir la note d'application « Cellular and biochemical HTRF assays measured in 1536-well microplates »), comme le montre la figure 7.
Dans la note d'application "Excellent assay performance of THUNDER™ TR-FRET cell-based cytokine assays performed on the PHERAstar FSX ", il est démontré que le PHERAstar FSX avec laser TRF présente une sensibilité et une plage dynamique beaucoup plus élevées qu'un lecteur de microplaques HTS concurrent.
Détecteurs dédiés
Le PHERAstar FSX est équipé de détecteurs à comptage de photons (PMT) pour la détection du TR-FRET. Les détecteurs ordinaires fournissent une valeur d'intégration de l'aire sous la courbe pendant le temps d'intégration. Les PMT à comptage de photons comptent chaque photon individuellement et surveillent ainsi l'ensemble de la courbe de désintégration du lanthanide.
Sur le lecteur PHERAstar FSX, la détection par comptage de photons permet de mesurer et d'afficher la courbe de décroissance de l'émission avec une résolution temporelle de 2 microsecondes. Cette fonction unique, appelée Decay Curve Monitoring, simplifie le développement des essais et permet d'optimiser les paramètres de synchronisation, d'améliorer la détection et de réduire le bruit de fond. Associée à l'assistant d'intégration, la surveillance de la courbe de décroissance offre une plateforme pour l'optimisation des essais TR-FRET.
Détection à double canal
La détection des deux longueurs d'onde d'émission est nécessaire, soit séquentiellement, soit simultanément. En règle générale, les lecteurs de microplaques mesurent les deux émissions l'une après l'autre. La détection simultanée présente toutefois plusieurs avantages.
Le système de détection à double émission simultanée (SDE) du PHERAstar FSX utilise deux photomultiplicateurs (PMT) appariés pour effectuer des mesures parallèles des deux longueurs d'onde d'émission. Le SDE réduit ainsi de moitié les temps de lecture et augmente le débit, tout en corrigeant les variations causées par les différences de volume de remplissage, de concentration ou d'énergie d'excitation. Ces caractéristiques permettent d'améliorer la sensibilité et de réduire le %CV. Les mesures SDE à canal unique sont combinées pour effectuer le calcul ratiométrique des résultats des deux canaux d'émission.
Miniaturisation des essais TR-FRET
Dans le cadre du criblage de médicaments, la réduction de l'échelle des essais est une étape essentielle. La miniaturisation permet de réduire les volumes d'échantillons tout en garantissant la reproductibilité, la fiabilité et la robustesse des essais. Les essais peuvent être réduits à des plaques de 3 456 puits, mais les formats 384 et 1 536 puits sont les plus courants.
Les essais TR-FRET peuvent être miniaturisés tout en conservant leur précision et leur reproductibilité, car l'intensité du signal dépend de la concentration du traceur et non de sa quantité. L'utilisation d'un lecteur de plaques très sensible, comme le PHERAstar FSX, renforce cette affirmation.
Dans l'exposé scientifique "Successfully downscaling screening assays : L'expérience de Servier", nous présentons une étude de cas dans laquelle le lecteur de plaques PHERAstar FSX a contribué de manière significative à la miniaturisation d'un essai HTRF, passant du format 384 au format 1536 puits. Sur le PHERAstar FSX, la miniaturisation a été combinée à une nouvelle dilution des réactifs et à une détection « à la volée » (un seul flash par puits). Il en résulte des valeurs Z' de haute qualité et une réduction significative de l'utilisation de réactifs et du temps de traitement.
Tests d'activité kinase
L'activité kinase est principalement analysée à l'aide de tests en sandwich mesurant le changement de phosphorylation d'un substrat, comme le montre la note d'applicationAnalyse de la phosphorylation de ERK1/2, p38αβγ, et STAT3 avec les immunodosages de kinases cellulaires THUNDER™ TR-FRET. Des tests de compétition peuvent également être utilisés pour contrôler les différents produits générés par la réaction (par exemple, l'ADP). On peut également utiliser un substrat de kinase marqué de façon fluorescente et un anticorps anti-phospho marqué au lanthanide (voir la figure 8), comme indiqué dans la note d'application "LanthaScreen TR-FRET tyrosine kinase and protein kinase C assay" (essai tyrosine kinase et protéine kinase C LanthaScreen TR-FRET). Ces méthodes peuvent également être appliquées aux protéases et à l'ubiquitination. Pour plus d'informations sur la détection de l'activité kinase, consultez notre article de blog "Kinase assays".
RCPG
Les essais visant à étudier les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) peuvent être de nature mécanistique ou fonctionnelle. Les essais fonctionnels se concentrent principalement sur la quantification des seconds messagers (par exemple l'IP1 ou l'AMPc), car ceux-ci peuvent s'accumuler dans la cellule en raison de l'activité d'inhibiteurs spécifiques. Ces messagers sont donc utilisés comme indicateurs, car leur concentration est en corrélation avec la liaison du ligand et l'activation du récepteur. Ceci est illustré dans les notes d'application "HTRF IP-One assay used for functional screening" et "GPCR activation is measured using Cisbio's cAMP and IP1 HTRF HTplex cell-based assay". Les tests mécanistes se concentrent sur l'organisation et l'oligomérisation des récepteurs sur la membrane cellulaire afin d'assurer la médiation de la signalisation.
Biomarqueurs
L'analyse des produits de signalisation en aval permet d'identifier les voies aberrantes qui pourraient jouer un rôle dans les maladies neurologiques, métaboliques et inflammatoires. La FRET résolue dans le temps permet de tester l'efficacité des composés ciblant spécifiquement ces maladies. Parmi les exemples d'application, citons le "développement d'un test rapide d'insuline par HTRF" pour les maladies métaboliques, en particulier le diabète sucré, la "détection de l'agrégation de la protéine tau humaine" dans lesmaladies neurodégénératives ainsi que les excellentes performances des tests de cytokines THUNDER™ TR-FRET sur cellules, réalisés sur le PHERAstar FSX pour la quantification des cytokines dans différentes maladies.
Dans l'exposé scientifique intitulé Targeting the type 1 cholecystokinin receptor to screen for novel obesity treatments, il est expliqué comment un essai TR-FRET a été utilisé pour détecter l'accumulation d'inositol monophosphate, un métabolite en aval de l'IP3. Sur la base de ces résultats, un autre essai de liaison basé sur la TR-FRET a été développé.
Analyse des événements cinétiques de liaison
En raison de difficultés techniques et d'un débit relativement faible, l'étude de la cinétique de la liaison ligand-récepteur a traditionnellement été menée à un stade tardif de la découverte de médicaments. Cependant, l'optimisation de ces paramètres aurait un impact positif sur l'efficacité, l'apparition d'effets secondaires, ainsi que sur l'efficacité et la durée d'action, ce qui bénéficierait grandement à la découverte de médicaments. De plus, la cinétique de liaison semble jouer un rôle dans l'agonisme biaisé. Il est donc souhaitable d'examiner la cinétique de liaison des candidats médicaments à un stade précoce, avant de passer aux modèles in vivo et aux études cliniques.
Les études cinétiques de liaison peuvent être réalisées efficacement sur des lecteurs de plaques permettant la détection cinétique TR-FRET pour le criblage et l'étude cinétique de composés à faible affinité, comme indiqué dans l'exposé scientifique "A TR-FRET approach to measure the kinetics of ligand-receptor binding and its application of fragment screening" (Une approche TR-FRET pour mesurer la cinétique de liaison ligand-récepteur et son application au criblage de fragments) et dans la note d'application "Analyze binding kinetics with HTRF" (Analyser la cinétique de liaison avec la HTRF).
