PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
Qu'est-ce que TR-FRET ?
Le FRET résolu dans le temps (TR-FRET) est une technologie de détection qui combine lafluorescence résolue dans le temps (TRF) et letransfert d'énergie par résonance de Förster (FRET). Le TR-FRET est principalement utilisé pour analyser les événements de liaison et pour le criblage de médicaments à haut débit.
Le transfert d'énergie par résonance de Förster décrit un transfert d'énergie entre deux fluorophores. Il porte le nom du scientifique allemand Theodor Förster qui a développé la théorie du transfert d'énergie par résonance.1 Pour qu'ilait lieu, un fluorophore donneur qui a absorbé de l'énergie lors de l'excitation et se trouve dans un état électroniquement excité, transfère de l'énergie à un second fluorophore accepteur. Le transfert d'énergie réduit l'intensité d'émission du donneur tout en augmentant l'intensité d'émission de l'accepteur.
Le transfert d'énergie dépend de deux conditions. Premièrement, la proximité spatiale entre le donneur et l'accepteur doit être comprise entre 20 et 90 Å. Le transfert d'énergie par résonance est inversement proportionnel à la sixième puissance de la distance entre le donneur et l'accepteur, il est donc très sensible aux changements de distance. Deuxièmement, un chevauchement entre le spectre d'émission du donneur et le spectre d'excitation de l'accepteur est nécessaire. Les "paires FRET" nécessitent une distance suffisante entre les pics d'émission pour pouvoir être distinguées optiquement, mais en même temps un chevauchement spectral suffisant pour permettre un transfert d'énergie efficace (fig. 1A).
En biologie, les protéines fluorescentes codées génétiquement sont les plus couramment utilisées. Les plus populaires sont la protéine fluorescente verte (GFP), la protéine fluorescente rouge (RFP), la protéine fluorescente cyan (CFP) et la protéine fluorescente jaune (YFP).2
Le FRET est généralement utilisé pour étudier les interactions moléculaires ou les événements de liaison et peut être employé pour déterminer l'affinité de liaison dedeux partenaires. La FRET est généralement utilisée pour étudier les interactions moléculaires ou les événements de liaison et peut être employée pour déterminer l'affinité de liaison de deux partenaires. Elle est évaluée en liant chaque partenaire de liaison à étudier à un fluorophore et en détectant le niveau de transfert d'énergie qui a lieu (fig. 1 B, C). Cependant, étant donné que la FRET standard est affectée par le bruit de fond dérivé de la lumière d'excitation diffusée et de l'autofluorescence, il est difficile d'obtenir des mesures très sensibles avec cette approche.
Principe du TR-FRET
La FRET résolue dans le temps élimine le bruit de fond de courte durée dérivé de la diffusion de la lumière d'excitation et de l'autofluorescence grâce à l'adoption de la fluorescence résolue dans le temps et à l'introduction d'une détection retardée dans le temps. Cela est possible grâce à l'utilisation de lanthanides comme donneurs. Ces fluorophores présentent de grands décalages de Stokes et des durées de vie d'émission pouvant atteindre quelques millisecondes.
Le TR-FRET repose sur le transfert d'énergie par résonance entre un lanthanide et un fluorophore à courte durée de vie, lorsqu'ils sont proches l'un de l'autre. Grâce à ces propriétés, la stabilité et la spécificité du TR-FRET sont améliorées par rapport au FRET standard. L'interférence du tampon ou du milieu est considérablement réduite par la fluorescence à longue durée de vie et par la détection ratiométrique des deux longueurs d'onde d'émission du donneur et de l'accepteur.
Le principe général de l'application de cette technologie est très similaire chez les différents fabricants de kits, dont les plus connus sontHTRF®, LANCE®,LanthaScreenTM et THUNDERTM. Le donneur et l'accepteur sont soit liés de manière covalente aux partenaires qui interagissent, soit un anticorps spécifique contre chacune des deux cibles (ou étiquettes) est marqué avec le donneur ou l'accepteur. En excitant le donneur, l'énergie sera transférée à l'accepteur, qui émettra en raison du transfert d'énergie par résonance de fluorescence, si les cibles sont proches. L'émission est proportionnelle à la quantité de liaison qui a lieu.
Technologie TR-FRET
Dans la technologie TR-FRET, différents fluorophores formant différentes paires sont utilisés, selon le fabricant.
- Les lanthanides donneurs sont soit l'europium, soit le terbium (fig. 2). Les ions europium et terbium n'étant que faiblement fluorescents, ils doivent être intégrés dans une "cage" collectrice de lumière pour émettre de la lumière. Les chélates et les cryptates sont utilisés à cette fin, car ils permettent à la fois de collecter et de transférer l'énergie. Par rapport à l'europium, le terbium a un rendement quantique 10 à 20 fois supérieur et un coefficient d'extinction molaire plus élevé, ce qui correspond à l'absorbance d'une molécule. Ces deux caractéristiques améliorent les performances de criblage.3 Lecomplexe chélate/cryptate-lanthanide est censé être extrêmement stable dans une large gamme de conditions chimiques et n'est pas sujet au photoblanchiment comme les fluorophores conventionnels.
- Les accepteurs sont des fluorophores conventionnels qui émettent dans les gammes verte et rouge. Pour le transfert d'énergie par résonance, les fluorophores rouges peuvent être combinés avec l'europium ou le terbium, tandis que les verts sont généralement combinés avec le terbium.
Détection TR-FRET
Les lanthanides sont généralement excités à 320 - 340 nm. L'émission de l'europium est généralement détectée à 620 nm, tandis que le terbium peut être détecté à 490 ou 620 nm selon le kit et le fabricant. Pour les accepteurs, l'émission est soit de 520 nm pour les fluorophores verts, soit de 665 nm pour les fluorophores rouges. L'émission du donneur est utilisée comme référence interne, tandis que l'émission de l'accepteur est un indicateur du transfert d'énergie (événement de liaison) qui a lieu (fig. 3).
Entre l'excitation et la détection de la fluorescence, un délai de l'ordre de la microseconde est appliqué. Cela permet d'éliminer la fluorescence de fond non spécifique de courte durée. L'émission est alors généralement détectée sur une période de temps (fenêtre de mesure) de quelques microsecondes (fig. 4). Les réglages du délai et de la fenêtre de mesure peuvent varier en fonction du kit et du fabricant.
Un rapport des signaux intégrés dans le temps des deux canaux d'émission est ensuite calculé. Cette mesure ratiométrique normalise le signal, élimine l'interférence du milieu et le quenching, et corrige les erreurs de manipulation du liquide ou la variabilité d'un puits à l'autre.
Avantages du TR-FRET
La sensibilité et la polyvalence ont rendu les essais TR-FRET largement populaires. La combinaison de la détection résolue dans le temps et des mesures ratiométriques augmente considérablement la fenêtre d'essai et réduit le bruit de fond. En outre, l'émission des lanthanides ne blanchit pas, est stable dans le temps et est compatible avec différents réactifs et conditions expérimentales.
Malgré ces avantages, le principal avantage de cette méthode est probablement que la détection de la paire liée ne nécessite pas de séparation physique des composants non liés afin de réduire le bruit de fond. En tant qu'essai dit homogène, le TR-FRET ne nécessite pas d'étapes de lavage intermédiaires et peut être exécuté comme un simple essai "add-and-read" (fig. 5), minimisant les étapes de manipulation et étant plus pratique et moins chronophage que lesELISA. Il est donc particulièrement adapté aux campagnes decriblage HTS automatisées.
Cependant, l'extinction du signal générée par des interactions externes avec le processus d'excitation intramoléculaire ou la fluorescence des composés de la bibliothèque ou des protéines biologiques peut constituer une limitation.3
Différents kits TR-FRET
Les kits d'essai TR-FRET sont disponibles auprès de différents fabricants. Bien que tous les essais soient basés sur une technologie commune et puissent tous être détectés sur unlecteur de microplaques, il existe des différences entre les kits et les fabricants. Celles-ci sont principalement liées aux différents types de donneurs et d'accepteurs, à leurs combinaisons, ainsi qu'aux différents moments du début de la détection et de la fenêtre de mesure.
- HTRF: HomogeneousTime-Resolved Fluorescence (fluorescence homogènerésolue dans le temps) estune technologie qui utilise quatre fluorophores spécifiques formant des paires différentes. Le lanthanide est un cryptate d'europium ou de terbium. Les accepteurs émettent dans le rouge : le XL665 de première génération, basé sur un pigment purifié à partir d'algues rouges, et le d2 de deuxième génération, similaire au XL665 mais plus petit, qui peuvent être combinés avec l'un ou l'autre cryptate. En outre, le terbium peut être combiné avec des fluorophores verts, ce qui permet un multiplexage potentiel (fig. 6).
- LANCE: Lanthanide Chelate Excite est une technologie TR-FRET basée sur un chélate d'europium et deux molécules acceptrices différentes, Surelight® APCet ULight™. Cette dernière est un fluorophore amélioré de deuxième génération avec un poids moléculaire plus faible (< 800 Daltons).
- LanthaScreen: initialement basé sur l'europium et l'allophycocyanine (APC) ou Alexa Fluor647,LanthaScreen afinalement étéoptimisé pour utiliser le terbium et la fluorescéine ou la GFP. L'utilisation du terbium est censée améliorer la flexibilité. L'APC est généralement utilisé comme conjugué de streptavidine en raison de sa grande masse moléculaire (>100 kDa) et est couplé à un substrat biotinylé dans un complexe tri-moléculaire. En combinaison avec le terbium, la fluorescéine et la GFP peuvent être utilisées pour marquer directement les substrats, ce qui permet de surmonter les problèmes d'encombrement stérique de l'europium-APC. En outre, l'utilisation de la GFP permet des essais basés sur des protéines de fusion GFP, même dans des cellules vivantes.
- Tests TR-FRETTranscreener®: détection de l'ADP, de l'AMP/GMP, de l'UDP et du GDP en tant que sous-produits de réactions enzymatiques biologiques courantes. Des immunodosages TR-FRET compétitifs sont disponibles pour chaque nucléotide. Leur quantification est utilisée pour analyser l'activité enzymatique des enzymes dépendantes des nucléotides. Lestests Transcreener utilisentune configuration compétitive dans laquelle les anticorps sont liés à un chélate de terbium et les nucléotides à un fluorophore rouge. Le déplacement du traceur par l'ADP, l'AMP/GMP, l'UDP et le GDP "natifs" empêche le transfert d'énergie par résonance. Ainsi, la présence de molécules cibles peut être reconnue par une réduction du signal.
- THUNDER TR-FRET: il s'agit d'une technologie basée sur une paire FRET présentant une compatibilité spectrale et un signal TR-FRET améliorés. Les tests THUNDER utilisent comme donneur un chélate d'europium à longue durée de vie et très stable, tandis que l'accepteur est un fluorophore de petit poids moléculaire émettant dans la gamme des rouges lointains.5
Toutes les technologies de dosage et leurs caractéristiques, y compris les pics d'excitation et d'émission, sont résumées dans le tableau 1. Outre les caractéristiques décrites, ces kits varient également en termes de temps d'intervalle et de fenêtres d'essai.
Tableau 1 : comparaison des kits de dosage TR-FRET les plus courants et de leurs pics d'excitation et d'émission
| Kit | Donneur | Type de cage | Excitation | Émission | Accepteur | Émission |
| LANCE | Europium | Chélate | 320 nm | 620 nm | ULightTM | 665 nm |
| LANCE | Europium | Chélate | 320 nm | 620 nm | Surelight® APC | 665 nm |
| LanthaScreen Eu | Europium | Chélate | 320 nm | 620 nm | AlexaFluor 647 | 665 nm |
| LanthaScreen Tb | Terbium | Chélate | 340 nm | 490 nm | Fluorescéine/GFP | 520 nm |
| HTRF rouge (Eu) | Europium | Cryptate | 320 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
| HTRF rouge (Tb) | Terbium | Cryptate | 340 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
| HTRF vert (Tb) | Terbium | Cryptate | 340 nm | 620 nm | Fluorescéine/GFP | 520 nm |
| Transcreener TR-FRET | Terbium | Chélate | 340 nm | 620 nm | HiLyte647 | 665 nm |
| THUNDER | Chélate d' | europium | 320 nm | 620 nm | Colorant rouge lointain | 665 nm |
Outre l'utilisation de kits disponibles dans le commerce, les paires de donneurs et d'accepteurs TR-FRET peuvent également être combinées librement, à condition que le spectre d'émission du donneur présente un chevauchement suffisant avec le spectre d'excitation de l'accepteur, comme le montre l'AN 388 : Liaison différentielle des dérivés du ∆9-tétrahydrocannabinol aux récepteurs cannabinoïdes de type 1 (CB1).
Lecteur de microplaques TR-FRET
La détection FRET résolue dans le temps est principalement réalisée sur des lecteurs de microplaques. La configuration de base d'un lecteur de microplaques TR-FRET comprend une source lumineuse, des filtres d'excitation et d'émission pour la sélection de la longueur d'onde et un détecteur à tube photomultiplicateur (PMT). Outre le mode de détection TRF, les lecteurs de plaques doivent être capables de mesurer deux canaux d'émission en une seule fois, de manière séquentielle ou simultanée. Le TR-FRET étant principalement utilisé pour le criblage à haut débit, la compatibilité avec les microplaques de 384 et 1536 puits est généralement obligatoire.
Sources lumineuses
Les complexes de chélates ou de cryptates sont généralement excités à 320 - 340 nm. Par conséquent, une lampe flash au xénon ou un laser d'excitation spécifique peuvent être utilisés comme source lumineuse. Unlaser TRF concentre plus d'énergie sur cette plage de longueurs d'onde spécifique et donne de meilleurs résultats avec une meilleure discrimination entre les signaux faibles et élevés.
Le PHERAstar FSX est équipé d'un laser TRF avec une fréquence de flash de 60 Hertz, ce qui offre un avantage significatif en termes de vitesse pour la détection TR-FRET. Le laser permet de mesurer une plaque complète de 1536 puits en 36 secondes tout en conservant un Z' > 0,8 pour les essais cellulaires et biochimiques (fig. 7), comme le montre la note d'application "Cellular and biochemical HTRF assays measured in 1536-well microplates" (essais HTRF cellulaires et biochimiques mesurés dans des microplaques de 1536 puits).
Dans la note d'application "Excellent assay performance of THUNDER™ TR-FRET cell-based cytokine assays performed on the PHERAstar FSX ", il est montré comment le PHERAstar FSX avec laser TRF présente une sensibilité et une plage dynamique beaucoup plus élevées qu'un lecteur de microplaques HTS concurrent.
Détecteurs dédiés
Le PHERAstarFSX est équipé de détecteurs à comptage de photons (PMT) pour la détection TR-FRET. Les détecteurs ordinaires fournissent en sortie une valeur d'intégration pour l'aire sous la courbe pendant le temps d'intégration. Les PMT à comptage de photons comptent chaque photon individuel et surveillent ainsi l'ensemble de la courbe de désintégration du lanthanide.
Sur le lecteur PHERAstar FSX, la détection par comptage de photons permet de mesurer et d'afficher la courbe de décroissance de l'émission avec une résolution temporelle de 2 microsecondes. Cette fonction unique, appeléeDecay Curve Monitoring, simplifie le développement des essais et aide à optimiser les paramètres de synchronisation, en améliorant la détection et en réduisant le bruit de fond. Associée à l'assistant d'intégration, la surveillance de la courbe de décroissance offre une plate-forme pour l'optimisation des essais TR-FRET.
Détection à double canal
La détection des deux longueurs d'onde d'émission est nécessaire, soit séquentiellement, soit simultanément. En général, les lecteurs de microplaques mesurent les deux émissions l'une après l'autre. La détection simultanée présente toutefois plusieurs avantages.
Le système de détection à double émission simultanée (SDE) du PHERAstarFSX utilise deux PMT appariés pour la mesure parallèle des deux longueurs d'onde d'émission. De cette manière, le SDE réduit de moitié les temps de lecture et augmente le débit, tout en corrigeant les variations causées par les différences de volume de remplissage, les concentrations ou les fluctuations de l'énergie d'excitation. Ces caractéristiques permettent d'améliorer la sensibilité et de réduire le %CV. Les mesures SDE à canal unique sont combinées pour le calcul ratiométrique des résultats des deux canaux d'émission.
Miniaturisation des essais TR-FRET
Dans le cadre du criblage de médicaments, la réduction de l'échelle des essais est une étape clé. La miniaturisation vise à réduire les volumes d'échantillons tout en maintenant la reproductibilité, la fiabilité et la robustesse des essais. Les essais peuvent être réduits à des plaques de 3456 puits - les formats 384 et 1536 puits sont cependant les plus courants.
Les essais TR-FRET peuvent être miniaturisés tout en maintenant la précision et la reproductibilité, car l'intensité du signal ne dépend pas de la quantité d'un traceur mais de sa concentration. L'utilisation d'un lecteur de plaques très sensible, comme le PHERAstarFSX, permet de renforcer cette affirmation.
Dans l'exposé scientifique "Successfully downscaling screening assays :L'expérience de Servier", nous présentons une étude de cas où le lecteur de plaques PHERAstarFSX a contribué de manière significative à la miniaturisation d'un essai HTRF du format 384 au format 1536 puits. Sur le PHERAstarFSX, la miniaturisation a été combinée à une nouvelle dilution des réactifs et à une détection "à la volée" (un seul flash par puits). Il en résulte desvaleurs Z' de haute qualité et une réduction significative de l'utilisation des réactifs et de la consommation de temps.
Tests d'activité kinase
L'activité kinase est principalement analysée à l'aide de tests en sandwich mesurant le changement de phosphorylation d'un substrat, comme le montre la note d'applicationAnalyse de la phosphorylation de ERK1/2, p38αβγ, et STAT3 avec les immunodosages de kinases cellulaires THUNDER™ TR-FRET. Des tests de compétition peuvent également être utilisés pour contrôler les différents produits générés par la réaction (par exemple, l'ADP). On peut également utiliser un substrat de kinase marqué de façon fluorescente et un anticorps anti-phospho marqué au lanthanide (fig. 8), comme indiqué dans la note d'application "LanthaScreen TR-FRET tyrosine kinase and protein kinase C assay" (essai tyrosine kinase et protéine kinase C LanthaScreen TR-FRET). Ces méthodes peuvent également être appliquées aux protéases et à l'ubiquitination. Pour plus d'informations sur la détection de l'activité kinase, consultez notre article de blog "Kinase assays".
RCPG
Les essais visant à étudier lesrécepteurs couplés aux protéines G (RCPG) peuvent être mécanistiques ou fonctionnels. Les essais fonctionnels se concentrent principalement sur la quantification des messagers secondaires (par exemple IP1 ou AMPc), car ceux-ci peuvent s'accumuler dans la cellule en raison de l'activité d'inhibiteurs spécifiques. En conséquence, les seconds messagers sont utilisés comme indicateur, car leur concentration est en corrélation avec la liaison du ligand et l'engagement du récepteur. Ceci est illustré dans les notes d'application "HTRF IP-One assay used for functional screening" et "GPCR activation is measured using Cisbio's cAMP and IP1 HTRF HTplex cell-based assay". Les tests mécanistes se concentrent sur l'organisation et l'oligomérisation des récepteurs sur la membrane cellulaire afin d'assurer la médiation de la signalisation.
Biomarqueurs
L'analyse des produits de signalisation en aval peut être utilisée pour identifier les voies aberrantes, jouant éventuellement un rôle dans les maladies neurologiques, métaboliques et inflammatoires. La FRET résolue dans le temps peut être utilisée pour tester l'efficacité des composés ciblant spécifiquement ces maladies. Parmi les exemples d'application, citons le "développement d'un test rapide d'insuline par HTRF" pour les maladies métaboliques, en particulier le diabète sucré, la "détection de l'agrégation de la protéine tau humaine" dans lesmaladies neurodégénératives et l'excellente performance des tests de cytokine THUNDER™ TR-FRET sur cellules effectués sur le PHERAstar FSX pour la quantification de la cytokine dans différentes maladies.
Dans l'exposé scientifique intitulé Targeting the type 1 cholecystokinin receptor to screen for novel obesity treatments, il est expliqué comment un essai TR-FRET a été utilisé pour détecter l'accumulation d'inositol monophosphate, un métabolite en aval de l'IP3. Sur la base de ces résultats, un autre essai de liaison basé sur TR-FRET a été développé.
Analyse des événements cinétiques de liaison
En raison de difficultés techniques et d'un débit relativement faible, la cinétique de la liaison ligand-récepteur a traditionnellement été étudiée à un stade tardif de la découverte de médicaments. Cependant, la découverte de médicaments bénéficierait grandement de leur optimisation, car les taux deKon et de Koff ont un impact sur l'efficacité, l'apparition d'effets secondaires, ainsi que sur l'efficacité et la durée d'action. En outre, la cinétique de liaison semble jouer un rôle dans l'agonisme biaisé. Il est donc souhaitable d'examiner la cinétique de liaison des médicaments candidats à un stade précoce, avant de passer aux modèles in vivo et aux études cliniques.
Les études cinétiques de liaison (fig. 9) peuvent être réalisées efficacement sur des lecteurs de plaques qui permettent la détection cinétique TR-FRET à des fins de criblage et l'étude cinétique de composés à faible affinité, comme indiqué dans l'exposé scientifique "A TR-FRET approach to measure the kinetics of ligand-receptor binding and its application of fragment screening" (Une approche TR-FRET pour mesurer la cinétique de liaison ligand-récepteur et son application au criblage de fragments) et dans la note d'application "Analyze binding kinetics with HTRF" (Analyser la cinétique de liaison avec la HTRF).
