PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
Qu'est-ce que la luminescence ?
Le mot luminescence est composé de "lumin" (lumière en latin) et du suffixe "-escence" (utilisé pour les processus ou les changements). Il s'agit donc d'un processus au cours duquel de la lumière est libérée. Par définition, la luminescence provient de sources froides et se distingue de l'émission à partir de sources chauffées (incandescence) telles que le fer chaud ou une bougie allumée1. Les signaux lumineux peuvent être générés lors de la conversion énergétique à partir d'un large éventail de sources d'énergie. Le processus transforme l'énergie invisible en rayonnement visible et peut être utilisé dans la nature comme mécanisme de défense, pour les LED sur les écrans ou à des fins d'analyse. Le contenu de cette page se concentre sur l'utilisation des méthodes de luminescence dans les sciences de la vie, explique leur contexte physique, fournit des informations sur leur détection sur les lecteurs de microplaques de luminescence et présente des essais courants de luminescence en microplaques. L'électroluminescence, la radioluminescence et la thermoluminescence ne font pas partie de ce contenu car elles ne sont pas pertinentes pour ce sujet.
Contexte physique de la luminescence
La luminescence est la production d'un signal lumineux par conversion d'énergie. Son application dans les sciences de la vie repose principalement sur deux sources d'énergie : l'énergie chimique ou l'énergie lumineuse, qui conduisent respectivement à la chimioluminescence et à la photoluminescence. Cette dernière est également à la base de la fluorescence (phosphorescence).
L'énergie d'une des deux sources est absorbée par une molécule et amène ses électrons à un niveau d'énergie supérieur (Fig. 1). Ce niveau étant instable, les électrons retombent de l'état excité à l'état fondamental. En retombant, les électrons libèrent de l'énergie sous forme d'énergie vibratoire, de chaleur et de photons. Ces derniers constituent l'émission luminescente2.
Dans les sciences de la vie, le terme "fluorescence" est généralement utilisé pour parler de la phosphorescence ou de la photoluminescence, tandis que le terme "luminescence" fait généralement référence à la chimiluminescence. Cette simplification s'appuie sur la différence de détection : la fluorescence nécessite une source d'excitation alors que la luminescence n'en a pas besoin (Fig. 2). Le présent document respecte cette nomenclature commune et se concentre sur la chimiluminescence, ci-après dénommée "luminescence".
La luminescence dans les applications des sciences de la vie
a) Chimiluminescence
Dans cette réaction, un substrat réagit dans un état électroniquement excité. Les électrons du produit excité ou de l'intermédiaire tombent dans leur état d'énergie le plus bas en émettant des photons, d'où la luminescence. Un exemple typique est la réaction du luminol en présence de peroxyde d'hydrogène (Fig. 3). Dans un environnement alcalin, ce substrat existe sous une forme (Dianion) qui réagit avec l'oxygène moléculaire O2. L'intermédiaire oxydé réagit ensuite en acide 3-aminophtalique (3-APA) excité électroniquement. La molécule retombe alors dans l'état énergétique qu'elle occupe normalement et libère de la lumière. Ce principe simple est également à la base de la chimioluminescence et de la bioluminescence améliorées. Il s'agit donc dans les deux cas de réactions de chimiluminescence.
b) Chimiluminescence améliorée (ECL)
L'ECL utilise des amplificateurs dans sa réaction de chimiluminescence. L'ECL utilise principalement du luminol en conjonction avec du peroxyde d'hydrogène. Cependant, l'oxydation est catalysée par une enzyme : la peroxydase de raifort (HRP). En outre, les réactions ECL contiennent des produits chimiques qui augmentent la production de lumière, tels que l'acide p-coumarique ou l'acide 4-iodophénylboronique. L'utilisation d'une enzyme pour catalyser la réaction chimique permet à l'ECL d'être utilisée dans des réactions liées à des enzymes. Sa principale application est l'immunoblot : les protéines sont séparées en fonction de leur taille, transférées sur une membrane et détectées par l'ECL. Les protéines d'intérêt immobilisées sur la membrane sont liées par un anticorps spécifique à la protéine. Un second anticorps couplé à la peroxydase de raifort est utilisé pour lier la protéine-anticorps à l'enzyme. Grâce aux enzymes et aux amplificateurs, un signal lumineux est généré uniquement à l'endroit où se trouve la protéine.
Le même principe est utilisé pour la quantification des biomolécules sur microplaques. Les tests ELISA avec lecture luminescente ont une sensibilité plus élevée et sont basés sur l'ECL. La protéine d'intérêt est immobilisée sur le puits de la microplaque et des anticorps spécifiques, un anticorps secondaire couplé à la HRP, un substrat et un amplificateur génèrent un signal lumineux qui augmente avec la concentration de la protéine.
c) Bioluminescence
La bioluminescence se produit dans les organismes vivants. Le terme couvre également les réactions utilisant des enzymes et des substrats dérivés à l'origine d'organismes vivants, bien qu'ils soient utilisés en dehors de l'organisme, ou issus de la bio-ingénierie pour en améliorer les caractéristiques. La bioluminescence est utilisée à différentes fins biologiques. Les lucioles utilisent leur capacité à briller pour attirer des partenaires. On pense que les méduses comme Aequorea victoria ou les crevettes des profondeurs utilisent la production de lumière pour repousser leurs ennemis biologiques. Lors de la détection du quorum, les bactéries , telles que la bactérie marine Vibrio fischeri, produisent un signal lumineux lorsqu'elles atteignent une certaine densité. Cela permet à la population de communiquer et de se coordonner.
Comment ces organismes parviennent-ils à être lumineux ? Grâce à une enzyme (la luciférase) qui catalyse l'oxydation de substrats (les luciférines) et libère ainsi des photons. Les organismes utilisent des enzymes et des substrats différents. En outre, les réactions d'émission de lumière nécessitent différents cofacteurs et produisent des longueurs d'onde variables. La figure 4 présente trois réactions de luciférases largement utilisées dans les essais des sciences de la vie.
d) Transfert d'énergie par résonance de la bioluminescence (BRET)
Le transfert d'énergie par résonance décrit le transfert d'énergie d'une molécule donneuse excitée électroniquement à un fluorophore accepteur. Le processus excite le fluorophore accepteur qui émet à son tour des photons. Si l'énergie du donneur est générée par la bioluminescence, le processus est appelé transfert d'énergie par résonance de la bioluminescence (BRET). Plusieurs conditions doivent être remplies pour permettre le transfert : le spectre d'émission de la molécule donneuse doit se superposer au spectre d'excitation du fluorophore accepteur. En outre, le donneur et l'accepteur doivent être proches (typiquement 1-10 nm), car le transfert diminue avec la distance. Par conséquent, le BRET est couramment utilisé pour mesurer l'interaction de deux biomolécules. Le résultat du BRET est l'intensité du fluorophore accepteur par rapport à l'intensité du donneur, connu sous le nom de rapport BRET. BRET1, BRET2 et NanoBRET utilisent différentes combinaisons d'enzymes et de fluorophores accepteurs, comme indiqué dans le tableau 1.
Tableau 1 - Types de BRET
| Nom de la luciférase | Luciferase donneuse | Substrat | Émission du donneur | Fluorophore accepteur | Émission de l'accepteur |
| BRET 1 |
Renilla |
Coelentérazine |
450-500 nm |
YFP | 515-560 nm |
| GFP |
510-540 nm | ||||
| BRET 2 | Renilla | DeepBlueC | 400-450 nm | GFP | 500-540 nm |
| NanoBRET | NanoLuc | Furimazine | 420-500 nm | NanoBRET 618 | 550-675 nm |
| TMR | 550-600 nm | ||||
| AlexaFluor 633 | 600-700 nm | ||||
| Vénus | 515-575 nm |
e) Luminescence flash
Les tests basés sur la luminescence pour les applications des sciences de la vie utilisent soit des réactions de flash, soit des réactions de lueur. La différence entre les deux est la durée du signal. Les tests flash produisent un signal pendant quelques secondes au maximum. L'intensité du flash lumineux produit est généralement enregistrée directement du début à la fin de la réaction. Cela signifie que les réactions flash doivent être démarrées par l'ajout d'un amorceur de réaction. Sur les lecteurs de microplaques, des injecteurs de réactifs sont nécessaires pour démarrer automatiquement la réaction et enregistrer le signal simultanément. Les tests de luminescence flash les plus courants sont la technologieDual-Luciferase Reporter™ ou lestests SPARCL.
f) Luminescence incandescente
Contrairement à la luminescence flash, la luminescence incandescente génère des signaux stables pendant des heures. Les tests ne nécessitent pas de distribution automatique et peuvent être lus sur une plus longue période. Les chercheurs, ainsi que les fournisseurs de kits, ont tendance à préférer les tests de luminescence lumineuse car ils sont plus faciles à manipuler et à détecter. Le test de viabilité CellTiterGlo® est l'un des principaux représentants de la luminescence incandescente.
Comment la luminescence est-elle détectée ?
Outre la détection ECL dans les western blots, les tests de luminescence utilisent généralement des microplaques (formats de 6 à 1536 puits) et sont quantifiés à l'aide d'un lecteur de microplaques. Cette section explique comment la luminescence est mesurée dans les microplaques.
Composants pour la détection de la luminescence
La luminescence est plus facile à détecter que la fluorescence ou l'absorbance, car aucune excitation n'est nécessaire. Cela signifie qu'il n'est pas nécessaire de disposer d'une source lumineuse ni de sélectionner une longueur d'onde d'excitation. Les composants minimaux nécessaires sont une lentille pour collecter le signal lumineux et un détecteur (Fig. 5). Un outil de sélection de la longueur d'onde est nécessaire pour mesurer le BRET et des guides de lumière peuvent être nécessaires pour des constructions de détection spécifiques.
a) Tube photomultiplicateur (PMT)
Les tubes photomultiplicateurs (PMT) servent de détecteurs dans la détection de la luminescence. Les PMT diffèrent par leur sensibilité (le plus petit signal détectable), leur bruit et leur capacité à mesurer d'autres modes de détection. De nombreux appareils de mesure sont équipés d'un PMT universel qui lit la luminescence ainsi que d'autres modes de détection. Ils présentent l'avantage d'être peu encombrants et peu coûteux, tout en offrant une sensibilité élevée. Des systèmes optiques optimisés permettent de mesurer des signaux très faibles. Un tel système optimisé est le chemin optique à l'air libre combiné à un module optique de luminescence plus que l'on trouve dans les lecteurs de microplaques PHERAstar FSX.
Les PMT dédiés à la détection de la luminescence permettent soit de réduire le bruit, soit d'utiliser un principe de comptage de photons. Alors que les deux PMT dédiés peuvent également détecter de faibles signaux, un système de comptage de photons est limité dans la détection de signaux plus élevés (Fig. 6).
b) Guides de lumière
Idéalement, le détecteur est placé directement au-dessus du puits. Si cela n'est pas possible, le signal lumineux doit être guidé du puits vers le détecteur. Cette tâche peut être réalisée soit par des lentilles et des miroirs, soit par un guide de lumière. Le guide absorbe une partie de la luminescence, ce qui diminue la sensibilité par rapport à un chemin optique à l'air libre. Ce dernier est présent sur leslecteurs de microplaques VANTAstar, CLARIOstar Pluset PHERAstar FSX.
c) Sélection de la longueur d'onde
Certaines applications nécessitent une détection à une longueur d'onde spécifique pour obtenir des résultats optimaux. Pour ce faire, des filtres optiques ou des monochromateurs sont placés sur le trajet optique. Les mesures BRET nécessitent une sélection de la longueur d'onde car deux signaux proviennent d'un seul et même échantillon. Pour distinguer la lumière provenant du fluorophore donneur de celle provenant du fluorophore accepteur, deux filtres sont nécessaires.
Les monochromateurs conventionnels à base de réseaux jouent un rôle secondaire dans les mesures de luminescence filtrée et de BRET en raison de leur sensibilité limitée. Cela est dû aux effets de diffusion et aux bandes passantes étroites. Cependant, une technologie de monochromateur utilisant des filtres variables linéaires (LVF) fournit la sensibilité nécessaire. Un monochromateur basé sur des LVF présente une transmission semblable à celle d'un filtre et offre des largeurs de bande allant jusqu'à 100 nm. Cela permet de s'assurer qu'un signal suffisant atteint le détecteur pour la luminescence filtrée telle que le BRET (Fig. 7).
Intervalle de temps de mesure, temps d'intégration ou temps d'acquisition
Un signal luminescent dure une seconde ou plus et est donc clairement différent de la fluorescence qui décroît en quelques nanosecondes. Par conséquent, le signal est généralement détecté sur une période de temps comprise entre 0,1 et 1 seconde. Cette période porte différents noms : temps de mesure, temps d'intégration et temps d'intervalle de mesure. Il dépend de plusieurs aspects qui doivent être mis en balance, tels que l'intensité du signal et le temps total de lecture d'une plaque.
Conseils, astuces et considérations pour les mesures de luminescence
La détection de la luminescence dans les lecteurs de microplaques est relativement facile car elle nécessite généralement peu de réglages. Cependant, certaines variables générales et liées à l'instrument ont un impact sur les mesures et la qualité des données.
Temps d'intégration
Comme indiqué ci-dessus, le temps d'acquisition dépend de plusieurs facteurs. Les aspects suivants doivent être pris en compte lors du choix du temps d'intégration :
a) Intensité du signal
La plupart des tests émettent suffisamment de lumière pour qu'un signal puisse être détecté en une demi-seconde à 0,02 seconde. Dans de très rares cas, il est nécessaire d'augmenter le temps d'intégration jusqu'à quelques secondes afin de détecter des différences dans les signaux de luminescence.
b) Luminescence flash et luminescente
Les signaux de luminescence sont généralement acquis pendant 0,1 à 1 seconde, car ils émettent un signal stable. Par conséquent, le temps de lecture total de la plaque, ainsi que le moment et la durée de la mesure du signal, jouent un rôle mineur. Il en va différemment pour les essais flash. Dans ce cas, il est important de recueillir le signal d'émission complet du début à la fin, ce qui peut prendre plusieurs secondes, en fonction de l'essai.
S'il est important de savoir à quoi ressemble la courbe du signal et quelle est l'émission maximale d'une réaction flash, il est nécessaire d'effectuer plusieurs mesures à des temps d'intégration très faibles. Par exemple, si une réaction dure environ une seconde, 50 mesures de 0,02 s peuvent être effectuées pour couvrir une seconde et surveiller l'évolution et la décroissance du signal.
c) Résolution temporelle
Ce point n'est pertinent que pour les mesures cinétiques. Si une réaction cellulaire ou biochimique est surveillée à l'aide d'un test de luminescence, le temps d'intégration est dicté par l'évolution de la réaction. Par exemple, dans lesdosages du calcium sur le site , les réponses se produisent dans une fourchette de 20 secondes après la stimulation et peuvent être représentées par 10 mesures toutes les 2 secondes. Si un seul puits est mesuré, un temps d'intégration de 1 ou 2 s peut être choisi et donne une résolution temporelle appropriée. Cependant, si plusieurs puits doivent être lus avec la même résolution temporelle (point de mesure pour chaque puits toutes les 2 secondes), le temps d'intégration doit être réduit pour mesurer les puits restants et éviter la perte de données.
d) Temps de lecture total
Le temps d'intégration étant appliqué à chaque puits, il contribue largement au temps de lecture total d'une plaque. En augmentant le temps d'intégration de chaque puits de seulement 0,2 s, le temps de lecture total d'une plaque complète de 96 puits augmente de 20 s, celui d'une plaque de 384 puits de plus d'une minute. Il est donc important d'utiliser des temps d'intégration faibles pour les plaques à haute densité (plaques à 384 ou 1536 puits) et dans les applications à haut débit où des milliers de plaques doivent être mesurées en une journée.
Gain
Le gain peut être considéré comme un facteur d'amplification qui déplace une fenêtre de plage dynamique fixe le long de la courbe de concentration de l'échantillon. Les signaux de faible intensité nécessitent des gains plus élevés, tandis que les signaux intenses nécessitent des gains plus faibles. En général, le gain est réglé de manière à obtenir une sortie de mesure maximale sur l'échantillon dont l'intensité est la plus élevée. Cela permet d'avoir la plus grande fenêtre dynamique possible entre les valeurs de mesure les plus élevées et les plus basses. Par conséquent, si des contrôles positifs avec un signal maximal sont utilisés avec des échantillons inconnus, le gain peut être ajusté sur ces derniers.
La possibilité de mesurer avec différents gains, ce qui permet d'obtenir une large gamme dynamique, permet de mesurer des signaux très faibles et des émissions lumineuses avec un seul instrument.
Le réglage du gain n'est pas nécessaire pour tous les lecteurs de microplaques luminescents, en fonction du détecteur et de l'automatisation du processus de réglage du gain.
Leslecteurs de microplaques àluminescence modernes effectuent automatiquementles réglages de gain. Cela permet non seulement de décharger le chercheur de cette responsabilité, mais aussi d'assurer aux mesures une large gamme dynamique. Ces instruments sont le CLARIOstar® Pluset le VANTAstar® avecsatechnologie Enhanced Dynamic Range.
Couleur de la plaque pour les mesures de luminescence
Les plaques blanches sont les mieux adaptées à la détection de la luminescence car elles reflètent le signal au lieu de l'absorber. Vous trouverez plus de détails sur le choix de la plaque dans notre article de blog :"La microplaque : l'utilité en pratique".
Il est important de noter que si un essai luminescent et un essai fluorescent sont combinés dans le même puits, il est préférable d'utiliser une plaque noire. La fluorescence mesurée dans une plaque blanche conduit à des valeurs très instables et à un signal de fond très élevé en raison de la réflexion de la lumière d'excitation. La détection de la fluorescence dans les plaques blanches est donc très problématique. La mesure de la luminescence sur des plaques noires réduit la fenêtre d'analyse. Toutefois, comme le bruit de fond est fortement réduit et que les mesures présentent des écarts plus faibles, les mesures devraient encore donner des résultats satisfaisants.
Qu'est-ce que la diaphonie et comment la contourner ?
Ladiaphonie est la lumière provenant d'un puits autre que le puits mesuré, qui est mesurée de manière non spécifique par le détecteur et qui modifie le signal du puits mesuré. Il s'agit d'un phénomène qui n'affecte que la détection de la luminescence.
Étant donné que la lumière produite par une réaction luminescente est diffuse, elle peut non seulement briller directement au-dessus du puits, mais aussi s'éloigner vers les puits voisins et directement vers le site de détection, même si un autre puits est mesuré. Cela conduit à des signaux biaisés, à des variations plus importantes et à une sensibilité globale plus faible. Le problème peut être résolu par différents moyens, en fonction du type de réaction et de la diffusion du signal.
Pour les tests flash qui ne brillent que pendant quelques secondes, il suffit de mesurer la plaque dans un ordre différent. Comme le signal décroît rapidement, les seuls puits affectés par la diaphonie sont les puits adjacents lorsqu'ils sont mesurés directement l'un après l'autre. Si l'on mesure un puits éloigné au lieu d'un puits adjacent, la diaphonie est considérablement réduite car le signal décroissant n'est pas détectable à l'endroit éloigné. A cet effet, les lecteurs de microplaques BMG LABTECH offrent un mode de lecture entrelacé. Ce mode mesure un puits sur deux jusqu'à la fin de la plaque. Ensuite, les zones omises sont mesurées. Cela permet aux signaux mesurés en premier de décroître jusqu'à ce que leurs voisins directs soient mesurés.
Les tests à lueur émettent des signaux stables pendant des heures et nécessitent d'autres stratégies pour éliminer la diaphonie. Les signaux indésirables peuvent atteindre le site de détection de deux manières : au-dessus de la plaque et à travers la paroi des puits (figure 8). Ces deux voies doivent être abordées différemment.
a) Blocage physique
Les ouvertures bloquent physiquement la lumière indésirable qui pénètre dans le détecteur par les puits. Une ouverture est un accessoire noir en forme de cuillère percée d'un trou qui est placé au-dessus de la microplaque (Fig. 8). A travers le trou, le signal du puits d'intérêt atteint le détecteur, tandis que toute la lumière provenant de son environnement est physiquement bloquée. Les lecteurs de microplaques multimodes PHERAstar®FSX, VANTAstar® et CLARIOstar® Plus de BMG LABTECH sontéquipés d'ouvertures pour une meilleure détection de la luminescence.
b) Réduction de la diaphonie mathématique
La lumière peut traverser la paroi en plastique d'un puits, même dans les microplaques blanches. Le type de microplaque influe considérablement sur la diaphonie qui traverse les parois d'une plaque. En général, les plaques à haute densité (par exemple, 1536 puits) présentent des fuites de lumière à travers les parois plus importantes que les plaques à faible densité, car les parois sont plus minces. Un deuxième aspect est la géométrie des puits : les puits carrés ont une plus grande diaphonie à travers les parois parce que les puits adjacents partagent une paroi. Les puits ronds ne partagent pas de paroi et présentent donc une diaphonie plus faible à travers la paroi. En outre, la couleur de la plaque influence la diaphonie à travers les parois de la microplaque : plus la plaque est foncée, plus la diaphonie est faible. Les plaques grises offrent un compromis entre la réduction de la diaphonie et la réflexion du signal.
S'il n'est pas possible d'optimiser davantage la plaque, une réduction mathématique de la diaphonie peut être appliquée aux données acquises. À cette fin, le débordement du signal vers les puits voisins est déterminé et un algorithme corrige les données. Les lecteurs de plaques PHERAstar®FSX,VANTAstar® etCLARIOstar®Plus de BMG LABTECH permettent de déterminer et de corriger automatiquement la diaphonie.
Emission lumineuse de la plaque
Les plaques blanches présentent une phosphorescence intrinsèque : la lumière est émise par la plaque elle-même après exposition à la lumière. Ce signal peut altérer les données, en augmentant les blancs et en réduisant la fenêtre d'analyse. Il est donc recommandé de préparer la plaque dans l'obscurité ou de la laisser dans l'obscurité environ 15 minutes avant la mesure.
Sélection des filtres
Les filtres sont principalement nécessaires pour les mesures BRET. Comme la luminescence présente souvent des signaux de sortie faibles, il est recommandé d'utiliser des filtres avec une large bande passante de 80 à 100 nm. Des bandes passantes plus larges permettent à plus de lumière d'atteindre le détecteur et augmentent la sensibilité de la mesure.
Essais de luminescence - À quoi sert la détection de la luminescence ?
Essais de rapporteur
Les tests rapporteurs utilisent des séquences régulatrices de gènes combinées à l'information génétique d'une molécule rapporteuse pour étudier soit le changement dans l'expression des gènes, soit les modifications dans la région régulatrice elle-même. L'information génétique du gène rapporteur doit être introduite dans les cellules. Si le gène rapporteur est actif, l'enzyme est transcrite et traduite. En présence d'un substrat, elle est convertie, la lumière est produite et son émission rend compte de l'activité des séquences régulatrices.
Essai de journaliste à double luciférase
Lesessais de rapporteur à double luciférase (DLR™) ajoutent un deuxième rapporteur au système. À côté de celui qui est couplé à une séquence régulatrice d'intérêt, une seconde luciférase contrôlée par un promoteur "de ménage" sert de contrôle interne. En utilisant le CLARIOstar ou le VANTAstar et leur option de balayage de la luminescence, il est possible d'identifier les luciférases correspondantes et de combiner, par exemple, jusqu'à six luciférases dans un seul essai multiplexe de la luciférase.
Viabilité cellulaire
Le test de viabilité le plus répandu est basé sur l'enzyme firefly. Son activité augmente avec les niveaux d'ATP, de même que l'émission de lumière. Les cellules viables produisent de l'ATP qui, après la lyse cellulaire, alimente la réaction. Par conséquent, l'émission est en corrélation avec le nombre de cellules et la viabilité. Outre les tests de viabilité basés sur l'ATP, les tests de luminescence peuvent mesurer la viabilité des cellules en temps réel. À cette fin, un pro-substrat ainsi que l'enzyme firefly sont ajoutés à la culture cellulaire. Le pro-substrat n'est réduit que par les cellules viables et est ensuite traité dans une réaction luminescente. De cette manière, la luminescence rend compte des changements de viabilité en temps réel. Pour en savoir plus sur ces tests, consultez notre exposé scientifique intitulé "Real-time cell health assays deliver better data with less effort" (Les tests de santé cellulaire en temps réel fournissent de meilleures données avec moins d'efforts). Les tests de viabilité cellulaire sont également utiles dans le cadre des travaux menés avec les PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) et les colles moléculaires dans la dégradation ciblée des protéines pour la découverte de médicaments. Il s'agit notamment de recherches portant sur la dégradation ciblée des protéines à partir d'interactions spécifiques entre des dégrons et des ligases connus.
Le métabolisme
Le métabolisme cellulaire englobe différentes étapes de la conversion moléculaire. La plupart des tests disponibles pour détecter les voies métaboliques cellulaires sont basés sur la luminescence. Le métabolisme de base se concentre sur l'utilisation des principaux nutriments tels que le glucose. La consommation de glucose peut être suivie, par exemple, par le test du gène du glucose. Pour une mesure indirecte de la consommation de glucose, le produit de dégradation du glucose - le lactate - peut également être détecté à l'aide du dosage du lactate. Les performances de ces deux tests sont démontrées dans la note d'application : le dosage du glucose et le dosage du lactate permettent de surveiller avec précision le métabolisme cellulaire du glucose dans un essai à base de cellules. Dans l'AppNote : ROS detection in a cell-based format using the Promega ROS-Glo™ assay, l'utilisation d'un test basé sur la luminescence pour la détection d'espèces réactives de l'oxygène produites de manière excessive est démontrée.
Liaison avec les récepteurs
Les récepteurs sont des cibles courantes pour les médicaments et leurs ligands sont des thérapeutiques possibles. La liaison des ligands à leurs récepteurs peut être étudiée dans des essais cellulaires utilisant le principe BRET. La luciférase est exprimée dans la partie extracellulaire du récepteur et un ligand est marqué avec un fluorophore accepteur approprié. Si le ligand se lie à son récepteur, le donneur et l'accepteur sont suffisamment proches pour transférer l'énergie et le rapport BRET augmente. La méthode permet également d'étudier la liaison au récepteur de composés non marqués. Ceux-ci peuvent entrer en compétition pour la liaison avec un ligand connu, marqué par un fluorophore. Si le rapport BRET diminue dans une telle configuration compétitive, un composé non marqué a déplacé la molécule acceptrice, ce qui entraîne une perte de transfert (Fig. 9).
La manière dont ces essais permettent d'étudier la pharmacologie des récepteurs est expliquée dans notre exposé scientifique "Real-time profiling of receptor pharmacology" (profilage en temps réel de la pharmacologie des récepteurs).
