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Che cos'è l'assorbanza?
In generale, l'assorbanza è un processo di interazione della luce con la materia. Quando la luce colpisce qualcosa che ne assorbe una parte, si parla di assorbanza. Naturalmente, la luce assorbita non va persa, ma viene trasformata in calore o energia chimica quando la molecola assorbente si eccita. L'assorbanza è un processo fisico che incontriamo ogni giorno quando vediamo i colori: La luce bianca, come quella del sole, contiene tutti i colori della luce visibile. Quando brilla sull'erba verde, questa assorbe tutti i colori tranne il verde. La luce verde viene riemessa ed è questo che dà all'erba il suo colore.
Sfondo teorico delle misure di assorbanza
Percorso di rivelazione in cuvette e micropiastre
Tradizionalmente, le misure di assorbanza venivano eseguite in una cuvetta: Una soluzione con un analita dalle caratteristiche di assorbanza note viene posta in una cuvetta. Un lettore di assorbanza determina l'assorbanza inviando una luce di intensità nota attraverso il campione e rilevando l'intensità dietro il campione. La luce che non arriva al rilevatore viene assorbita o dispersa. La parte dispersa viene determinata separatamente misurando opportuni bianchi e viene sottratta da questo valore per ottenere l'assorbanza pura della sostanza di interesse.
Il risultato delle misure di assorbanza - trasmissione, assorbanza e densità ottica
La porzione di luce che riesce a passare il campione è detta anche trasmissione e viene indicata principalmente in percentuale (Fig. 2). Più l'analita si trova in soluzione, più la luce viene assorbita da esso e più bassa è la trasmissione. L'assorbanza, invece, è la parte di luce assorbita dall'analita. È il valore assoluto del logaritmo (alla potenza di 10) della trasmissione1. Ecco le equazioni matematiche e alcuni numeri che spiegano cosa si intende per trasmissione e assorbanza:
Trasmissione: T =Iout /Iin
Assorbanza: A =-log10T
Tabella 1: Esempi di valori di trasmissione e di assorbanza
| Trasmissione | Assorbanza |
| 0,1 (o 10%) | 1 OD |
| 0,01 (o 1%) | 2 OD |
| 0,001 (o 0,1%) | 3 OD |
Assorbanza in chimica e scienze biologiche - quantificare una sostanza in soluzione
Dopo aver eseguito una misura di assorbanza, il risultato è un valore dato in trasmissione o in densità ottica. Tuttavia, se l'obiettivo della misurazione è la quantificazione di una sostanza in soluzione, la domanda ovvia è come convertire il segnale in un valore di concentrazione. In generale, esistono due modi: impiegando la legge di Beer-Lambert o misurando una curva standard in parallelo a campioni di concentrazione sconosciuta.
Legge di Beer-Lambert
La legge di Beer-Lambert descrive la relazione tra assorbanza, lunghezza del percorso e concentrazione di una sostanza assorbente:
A=c*d*ε
Modificata in c: c=A/(d*ε)
Legge di Beer-Lambert con A - assorbanza, c - concentrazione, d - lunghezza del cammino ottico, ε - coefficiente di estinzione.
La legge dice che l'assorbanza è lineare rispetto alla concentrazione moltiplicata per la lunghezza del percorso e il coefficiente di estinzione. La lunghezza del cammino ottico si riferisce alla lunghezza del campione che la luce deve attraversare. Ad esempio, in una cuvetta il percorso è standardizzato a 1 cm. Il coefficiente di estinzione è una costante specifica per una sostanza assorbente e una specifica lunghezza d'onda, in genere il massimo di assorbanza della sostanza. Fornisce informazioni sulla forza con cui la sostanza specifica assorbe la luce alla specifica lunghezza d'onda. Ad esempio, il coefficiente di estinzione di massa della sieroalbumina bovina (BSA) è di 0,67 µl*cm-1*µg-1. Di conseguenza, una soluzione di 1 µg/µl di BSA con una lunghezza di percorso di 1 cm ha un'assorbanza di 0,67 OD.
La legge di Beer-Lambert è molto utile perché consente di quantificare le sostanze assorbenti senza la necessità di aggiungere altri reagenti. Tuttavia, è limitata come indicato di seguito.
La legge di Beer-Lambert può essere utilizzata solo se
- l'analita assorbe la luce a una specifica lunghezza d'onda
- La lunghezza del cammino ottico è nota
- Il coefficiente di estinzione dell'analita è noto.
- L'assorbanza dei reagenti tampone non si sovrappone all'assorbanza dell'analita.
Utilizzo di una curva standard
Se uno di questi criteri non è applicabile, esiste la possibilità di misurare indirettamente gli analiti e/o di utilizzare una curva standard. Ad esempio, i saggi colorimetrici per la quantificazione delle proteine, come il saggio di Bradford, dipendono da una sostanza che aumenta l'assorbanza in presenza di proteine. L'aumento viene misurato in una curva standard con concentrazioni note di proteine e nei campioni, in modo da poterne calcolare la concentrazione.
Come viene rilevata l'assorbanza?
Fonte di luce
Si spiega da sé: la misurazione della trasmissione/assorbimento della luce richiede innanzitutto la luce. Per la misurazione dell'assorbanza si possono utilizzare diverse sorgenti luminose. Esse si differenziano per l'intervallo spettrale coperto, per l'intensità e per la stabilità della luce emessa.
Le lampade alogene al tungsteno coprono l'intervallo da 360 nm a oltre 1000 nm e sono spesso utilizzate per la loro economicità. Le lampade allo xeno, invece, coprono la regione spettrale da 220 nm a 1000 nm e coprono la gamma UV dello spettro. Ciò rende possibile il rilevamento e la quantificazione degli acidi nucleici (260 nm) e delle proteine (280 nm). I lettori di micropiastre ad assorbanza BMG LABTECH sono dotati di una lampada allo xeno per le misure di assorbanza e quindi offrono la massima flessibilità per misurare qualsiasi lunghezza d'onda tra 220 e 1000 nm, o l'intero spettro di lunghezze d'onda.
Campione
I liquidi di interesse devono essere trasferiti in una cuvetta o in una micropiastra per poterne misurare l'assorbanza. Il materiale della cuvetta e della micropiastra è sempre trasparente per garantire la massima trasmissione della luce, poiché l'assorbanza della soluzione e non del materiale è di interesse per il ricercatore. Tuttavia, esistono diversi materiali comuni che si differenziano tra loro. Il polistirene è il più utilizzato e può essere modificato per fornire specifiche caratteristiche di legame, sia per colture cellulari che per applicazioni ELISA. Tuttavia, non sono trasmissibili nella gamma UV, il che richiede l'uso di piastre speciali di copolimero olefinico ciclico per misurare l'assorbanza al di sotto dei 400 nm.
Volume del campione
Un secondo aspetto da considerare è il volume del campione necessario per ottenere misure di assorbanza affidabili. Le cuvette standard richiedono circa 4,5 ml, mentre le cuvette a semi-micro volume consentono di ridurre il volume a 1,5 ml e le cuvette a micro volume se la cavano con 70 µl. La misurazione in cuvetta è orizzontale: la luce viene diretta da un lato nel campione e sul lato opposto viene rilevata la luce trasmessa. Pertanto, la geometria delle cuvette fornisce una lunghezza di percorso standardizzata di 1 cm. Questa è una delle principali differenze rispetto alle misure su micropiastra, che si svolgono in verticale (dall'alto verso il basso o dal basso verso l'alto). Di conseguenza, la lunghezza del cammino ottico varia anche con il volume del campione e richiede l'uso di volumi uguali per un esperimento. Inoltre, gli effetti del menisco giocano un ruolo importante per la lunghezza del percorso nelle misure di assorbanza su micropiastra, come spiegato in dettaglio nella nota HowTo: Come gestire la lunghezza del percorso e il menisco nelle micropiastre. Le misure eseguite al centro del pozzetto di una micropiastra hanno un cammino ottico molto più breve in presenza di un forte menisco rispetto a una misura senza menisco. Ciò è di particolare importanza quando si applica il metodo di Beer-Lambert o quando si hanno menischi molto variabili in un esperimento. Nelle soluzioni acquose è possibile correggere le variazioni di lunghezza di percorso dipendenti dal menisco sfruttando l'assorbanza dell'acqua (correzione della lunghezza di percorso del picco d'acqua).
In genere si utilizzano piastre standard a 96 pozzetti con volumi di campione compresi tra 100 e 300 µl, che si traducono in una lunghezza di percorso approssimativa compresa tra 2,9 e 7,4 mm. Potrebbe essere necessario ridurre ulteriormente il volume del prezioso campione senza compromettere la lunghezza del percorso. A tal fine, si possono utilizzare piastre a metà area o a densità più elevata. Esse offrono un'area di pozzetti più piccola ma la stessa altezza delle piastre standard da 96 pozzetti e, quindi, forniscono lunghezze di percorso elevate con volumi inferiori.
Il bianco appropriato
Per correggere le misure di assorbanza da assorbanze indesiderate provenienti da componenti del tampone, dalla piastra e da effetti di dispersione della luce, si misura un bianco in parallelo ai campioni. Il bianco appropriato contiene tutti i componenti del test tranne l'analita. Al contrario, ciò significa che un bianco di PBS o di acqua è spesso insufficiente.
Occorre prestare particolare attenzione alle particelle presenti nei campioni analizzati e nei bianchi. Le particelle disperdono la luce e aumentano il valore di assorbanza misurato, poiché meno luce raggiunge il rivelatore. Quando le particelle si muovono nella soluzione, vengono rilevate quando bloccano il percorso della luce. Quando si spostano fuori dal percorso di rilevamento, non vengono misurate. Questo fenomeno aumenta la variabilità dei dati di assorbanza. Se non è possibile rimuovere le particelle dalle soluzioni misurate, si raccomanda di coprire un'area più ampia del pozzetto della micropiastra nella misurazione dell'assorbanza, una caratteristica che tutti i dispositivi BMG LABTECH offrono per le misure di assorbanza.
Rivelatore delle misure di assorbanza
Dopo che la luce trasmessa ha superato il campione, deve essere rilevata. Nei lettori di micropiastre vengono comunemente utilizzati due diversi tipi di rilevatori: un tubo fotomoltiplicatore (PMT) o uno spettrometro CCD. I sistemi basati su PMT richiedono la selezione della lunghezza d'onda prima della rilevazione. Ciò avviene tramite filtri ottici o monocromatori che selezionano la lunghezza d'onda desiderata prima di guidarla verso il campione. La luce trasmessa della lunghezza d'onda desiderata raggiunge quindi il PMT. Il PMT amplifica il segnale della luce trasmessa e produce una tensione indicativa della sua intensità. Per eseguire la scansione dell'assorbanza su una gamma di lunghezze d'onda, i sistemi basati su PMT utilizzano un monocromatore che seleziona la lunghezza d'onda desiderata per ogni punto dello spettro e la misura in sequenza.
Questa è la differenza principale rispetto al secondo tipo di rilevatori di assorbanza, lo spettrometro. Esso divide la luce trasmessa in diverse lunghezze d'onda che vengono dirette su un rilevatore CCD, catturando l'intensità di tutte le lunghezze d'onda contemporaneamente. In questo modo, gli spettri e le misurazioni di singole o poche lunghezze d'onda possono essere acquisiti in un tempo simile. Ad esempio, gli strumenti BMG LABTECH utilizzano spettrometri UV/vis per misure di assorbanza che acquisiscono un intero spettro (220 1000 nm) in meno di un secondo.
