CLARIOstar Plus
Most flexible Plate Reader for Assay Development
Che cos'è l'intensità di fluorescenza?
La fluorescenza si basa sulla fotoluminescenza, un processo di bagliore ed emissione di luce. È un processo fisico in cui la luce viene emessa dopo essere stata assorbita da una sostanza. L'intensità della fluorescenza indica la quantità di luce (fotoni) emessa. L'entità dell'emissione e dipende dalla concentrazione del fluoroforo eccitato.
La fluorescenza è creata dall'assorbimento di energia (luce) da parte di molecole fluorescenti, chiamate fluorofori. L'energia assorbita porta gli elettroni a un livello energetico superiore. Poiché questo stato eccitato è instabile, gli elettroni ricadono allo stato fondamentale e quindi emettono luce (fig. 1).
Una parte minore dei fotoni assorbiti viene convertita in movimento e calore. Pertanto, l'energia rilasciata quando gli elettroni ricadono allo stato energetico inferiore è sempre minore all'energia necessaria per eccitare l'elettrone. Poiché le radiazioni a onde più lunghe sono meno energetiche di quelle a onde corte, l'emissione ha sempre una lunghezza d'onda superiore a quella della luce utilizzata per l'eccitazione. La distanza tra i massimi di eccitazione e di emissione (picchi) è chiamata spostamento di Stokes (fig. 2).1
La caratteristica della luce di eccitazione (assorbimento) a una lunghezza d'onda inferiore rispetto alla luce di emissione apre la possibilità di utilizzare l'intensità della fluorescenza a fini analitici. I fluorofori possono essere rilevati eccitandoli a una specifica lunghezza d'onda e misurandone l'intensità di emissione a una lunghezza d'onda superiore. L'intensità di fluorescenza è linearmente correlata alla concentrazione del fluoroforo eccitato ed è quindi adatta per analisi quantitative.
L'intensità della fluorescenza è ampiamente utilizzata nelle applicazioni delle scienze della vita: nella microscopia per localizzare e quantificare le biomolecole, nella citometria a flusso per analizzare le cellule e nei saggi basati su micropiastre per quantificare le molecole, le attività enzimatiche e persino l'interazione tra le molecole. Questa pagina si concentra sull'uso dell'intensità di fluorescenza nei saggi su micropiastra, su come viene rilevata, su cosa considerare per le misurazioni dell'intensità di fluorescenza e su quali saggi sono comunemente utilizzati.
Fluorofori
Un fluoroforo (anche fluorocromo) è un composto fluorescente in grado di emettere luce su eccitazione luminosa. Sono note migliaia di molecole che presentano caratteristiche di fluorescenza.2 Sidifferenziano per:
Dimensione molecolare
Molti fluorofori sono composti chimici di piccole dimensioni molecolari che possono essere facilmente coniugate ad altre molecole. Le proteine fluorescenti, come le proteine fluorescenti verdi o rosse (GFP o RFP), hanno dimensioni maggiori e possono essere espresse dalle cellule. Vengono utilizzate per marcare le proteine per studi di espressione, per biosensori espressi in modalità endogena o semplicemente come marcatori di quantificazione cellulare. Leggete qui come l'efficienza di trasfezione basata su GFP e mcherry può essere monitorata accuratamente con VANTAstar.
Lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione
Le caratteristiche di eccitazione ed emissione della luce di un fluoroforo sono visualizzate sotto forma di spettri: in un sistema di coordinate, i nanometri sono indicati sull'asse x e l'intensità sull'asse y. Le curve sono normalizzate al 100% e consentono una rapida identificazione delle lunghezze d'onda massime di eccitazione ed emissione e dello spostamento di Stokes. Queste informazioni sono importanti per scegliere il fluoroforo giusto per un test. Deve essere compatibile con il sistema di rilevazione, con la potenziale autofluorescenza e con gli altri fluorofori, se in un esperimento ne vengono utilizzati diversi.
Rendimento quantico
La resa quantica è una misura dell'efficienza con cui una molecola eccitata converte i fotoni assorbiti in luce di emissione. In combinazione con la misura in cui la luce viene assorbita (coefficiente di estinzione), la resa quantica fornisce un'indicazione della luminosità di un fluoroforo.
Le coppie FRET sono costituite da due fluorofori
La FRET (Förster´s Resonance Energy Transfer) descrive il trasferimento di energia da un fluoroforo donatore a un fluoroforo accettore. Il trasferimento avviene quando l'accettore viene eccitato dalla luce di emissione proveniente dal donatore e ha luogo solo se entrambi i fluorofori sono in prossimità. La FRET è spesso utilizzata per studi di legame molecolare o neibiosensori. Questi ultimi cambiano la loro conformazione quando l'analita si lega e avvicina i due fluorofori. Affinché la FRET abbia luogo, la coppia di fluorofori deve avere una sovrapposizione tra lo spettro di emissione del donatore e lo spettro di eccitazione dell'accettore.3
Rilevazione dell'intensità della fluorescenza
Anche se i fluorofori differiscono tra loro, la base della misurazione dell'intensità di fluorescenza nelle micropiastre è la stessa (fig. 4):
- Una sorgente luminosa produce luce a banda larga
- L'intervallo di lunghezze d'onda di eccitazione viene filtrato dalla luce a banda larga.
- La gamma di lunghezze d'onda di eccitazione eccita il fluoroforo
- L'intervallo di lunghezze d'onda di emissione viene filtrato dalla luce di emissione.
- Un rilevatore quantifica la luce di emissione filtrata
A differenza dell'assorbanza, la fluorescenza non è una misura assoluta. L'intensità del segnale fluorescente è di solito relativa ad altre misurazioni o a una misurazione di refenza effettuata da uno strumento. Di conseguenza, ilettori di piastre a fluorescenza misurano il segnale luminoso emesso da un campione in unità fluorescenti relative (RFU).
Sorgenti di luce
Esistono tre sorgenti luminose comunemente utilizzate nei lettori di micropiastre. Indipendentemente dalla sorgente luminosa di cui è dotato il lettore, le sue prestazioni possono influire sui risultati delle misurazioni. Per saperne di più, leggete la nota HowTo: Come influisce il numero di flash sui risultati di misurazione?
Lampada flash allo xeno
Le lampade flash allo xeno emettono luce nell'intervallo tra 200 e 2500 nm. Sono quindi adatte a eccitare qualsiasi molecola che assorba la luce dall'intervallo UV all'intervallo infrarosso. Presentano un'elevata emissione di segnale e sono di lunga durata. Grazie a questi vantaggi, le lampade flash allo xeno sono utilizzate come sorgenti di eccitazione di fluorescenza nei lettori di piastre BMG LABTECH.
Lampada alogena al tungsteno
Le lampade alogene emettono luce a partire da circa 360 nm e non sono adatte a misurare l'intensità della fluorescenza UV. Rispetto alle lampade allo xeno, le lampade al tungsteno hanno una durata di vita più breve, un'intensità di uscita inferiore e una minore sensibilità, se utilizzate per il rilevamento della fluorescenza nei lettori di micropiastre.
I LED
I diodi a emissione luminosa (LED) emettono luce ad alta intensità ma solo con una specifica larghezza di banda. Di conseguenza, sono necessari più diodi per diverse lunghezze d'onda di eccitazione, rendendo più complicata e costosa la rilevazione flessibile di più fluorofori.
Selezione della lunghezza d'onda
Le sorgenti di eccitazione a banda larga possono coprire ampi intervalli di lunghezze d'onda, dall'UV fino alla luce infrarossa. Per eccitare in modo specifico il fluoroforo di interesse ed evitare segnali non specifici, la luce di eccitazione a banda larga deve essere selezionata (filtrata) per trasmettere solo la luce intorno al massimo di eccitazione del fluoroforo. Allo stesso modo, la luce di emissione viene filtrata per il massimo di emissione del fluoroforo. In questo modo, solo la fluorescenza proveniente dal fluoroforo di interesse viene guidata al rivelatore. Di conseguenza, la sensibilità del test viene migliorata ottimizzando l'intervallo di lunghezze d'onda.
La sensibilità del rilevamento in alcuni lettori di micropiastre a intensità di fluorescenza è migliorata dall'uso di un'ulteriore selezione tra eccitazione ed emissione: unospecchio dicroico. Lo specchio dicroico trasmette tipicamente la luce superiore a una specifica lunghezza d'onda, ma blocca la luce a lunghezze d'onda inferiori. Il cut-off si trova tra l'eccitazione e l'emissione e garantisce una minore dispersione della luce di eccitazione nel rivelatore.
Filtri
I filtri ottici sono sottili vetrini rotondi o rettangolari con un rivestimento ottico. Il rivestimento trasmette solo la luce di una certa lunghezza d'onda. I fluorofori con diversi massimi di eccitazione ed emissione richiedono filtri diversi. Un filtro prende tipicamente il nome dalla lunghezza d'onda media di trasmissione, che spesso è il massimo di eccitazione o di emissione del fluoroforo. Inoltre, un filtro ottico ha una larghezza di banda definita (o banda passante), che indica l'ampiezza dell'intervallo di trasmissione. Ad esempio, un filtro da 485 nm con una larghezza di banda di 10 nm filtra la luce bianca nell'intervallo tra 480 e 490 nm.
Monocromatori
A differenza dei filtri ottici, i monocromatori sono in grado di selezionare la luce di diverse lunghezze d'onda a seconda delle esigenze. Nei lettori di micropiastre si utilizzano due tipi di monocromatori: i monocromatori convenzionali a reticolo e i monocromatori a filtro lineare variabile. Nei monocromatori a reticolo, le lunghezze d'onda sono selezionate dalla diffrazione della luce bianca nei suoi colori. Le lunghezze d'onda vengono poi selezionate da una fenditura, che blocca fisicamente la luce indesiderata e trasmette solo quella desiderata. Lo svantaggio del metodo a griglia è la bassa trasmissione della luce e la presenza di luce indesiderata (stray light), che potrebbe raggiungere il rivelatore e ridurre la sensibilità complessiva della fluorescenza.
Il monocromatore a filtro variabile lineare (LVF) supera il problema della luce parassita (stray light) in quanto non frammenta la luce, ma la filtra letteralmente. Il monocromatore LVF utilizza due vetrini con un rivestimento gradiente. È possibile selezionare qualsiasi lunghezza d'onda con qualsiasi larghezza di banda facendo scorrere i due filtri lineari l'uno contro l'altro. Il monocromatore LVF ha una trasmissione simile a quella di un filtro, elimina la luce parassita e ha quindi prestazioni migliori rispetto ai monocromatori a diffrazione (fig. 6). L'uso di filtri lineari variabili nei lettori di micropiastre è una tecnologia brevettata da BMG LABTECH.
Rivelatore
L'intensità della fluorescenza nei lettori di micropiastre viene rilevata con tubi fotomoltiplicatori (PMT). Questi tubi moltiplicano il segnale per effetto fotoelettrico e convertono la luce in un segnale elettrico. Per la misurazione dell'intensità di fluorescenza nei lettori di micropiastre, vengono utilizzati due diversi PMT, che si differenziano per l'intervallo di lunghezze d'onda di sensibilità. Un PMT blu/verde a basso rumore è sensibile nell'intervallo fino a 740 nm e viene spesso utilizzato anche per le misure di luminescenza. Un PMT con spostamento verso il rosso misura la fluorescenza in modo sensibile fino a 900 nm e copre quindi anche i fluorofori rossi e infrarossi. Questi sono spesso utilizzati per le misurazioni basate sulle cellule, poiché l'autofluorescenza è ridotta in questo intervallo di lunghezze d'onda.
Come impostare una misura di fluorescenza su un lettore di micropiastre
Micropiastra
Le quantificazioni dell'intensità di fluorescenza richiedono una piastra nera, in quanto riduce il segnale aspecifico e la riflessione della luce di eccitazione. Maggiori dettagli sulla scelta della piastra sono disponibili nel nostro blog post"La micropiastra: utilità nella pratica".
Impostazioni del filtro e del monocromatore
La scelta del filtro giusto è essenziale per una precisa determinazione dell'intensità di fluorescenza. Come già detto, le lunghezze d'onda medie dovrebbero essere pari o vicine ai massimi di eccitazione ed emissione. Tuttavia, ci sono alcuni aspetti da tenere in considerazione:
a) Distanza tra i filtri
Se i bordi dei filtri di eccitazione e di emissione sono troppo vicini l'uno all'altro, la luce di eccitazione può passare attraverso e raggiungere il rivelatore. In questo caso, il segnale del fluoroforo scompare nella luce di eccitazione e non è più misurabile. La vicinanza dei filtri dipende dalla qualità dei filtri e dall'uso di uno specchio dicroico. In genere, la massima lunghezza d'onda di eccitazione trasmessa e la minima lunghezza d'onda di emissione trasmessa dovrebbero essere distanti 30 nm (fig. 7).
b) Larghezza di banda
La larghezza di banda dei filtri varia da pochi nanometri a 100 nm. La larghezza di banda influenza la quantità di luce che può passare il filtro. I filtri a bassa larghezza di banda (~10 nm) sono consigliati per i fluorofori luminosi o per i campioni complessi con elevata autofluorescenza. Un esempio tipico sono i fluorofori verdi come AlexaFluor488, FITC o GFP in un ambiente cellulare.
I filtri a larghezza di banda più ampia sono consigliati per i fluorofori a bassa emissione se emettono in un intervallo in cui l'autofluorescenza è bassa (emissione <600 nm) o se il tampone non contiene altri composti fluorescenti. BMG LABTECH seleziona i filtri in base agli spettri di eccitazione ed emissione del fluoroforo. Inoltre, le coppie di filtri vengono misurate e abbinate tra loro, in modo da poter essere certi di ricevere i migliori filtri possibili. Le impostazioni predefinite per i fluorofori più comuni sono già memorizzate per il monocromatore, in modo che il lavoro di selezione non sia lasciato al ricercatore.
c) Le misure FRET richiedono due canali di emissione
Le considerazioni precedenti valgono anche per le misure FRET. Tuttavia, è necessario notare che due emissioni devono essere registrate separatamente. Il fluoroforo donatore eccitato emette luce a una lunghezza d'onda specifica se non c'è un accettore nelle vicinanze. Se un fluoroforo accettore è vicino, il donatore trasferisce l'energia all'accettore che emette luce a una lunghezza d'onda superiore. Ciò significa che sono necessari due filtri di emissione, uno dei quali permette di trasmettere solo l'emissione del donatore e l'altro solo quella dell'accettore.
Gain di fluorescenza
Il gain di fluorescenza è un fattore di amplificazione o, più precisamente, la tensione elettrica del rivelatore alla quale viene amplificato il segnale luminoso in ingresso. Modificando il gain si sposta l'intervallo dinamico di rilevamento lungo la curva di concentrazione dell'analita del test. Tuttavia, l'ampiezza dell'intervallo dinamico è fissa e non cambia.
I segnali deboli necessitano di una grande amplificazione (gain elevato), mentre i segnali luminosi necessitano di una minore amplificazione (gain ridotto). Un gain selezionato in modo errato può rendere inutilizzabili i dati misurati perché superano l'intervallo di misura o perché le differenze non vengono più rilevate. I dati che evidenziano questi effetti sono riportati nella nota HowTo: Come ottimizzare l'impostazione del gain del lettore di micropiastre? In genere, il gain viene impostato in modo da avere un'uscita di misura massima sul campione con l'intensità più elevata prevista. Questo per avere la più ampia finestra dinamica possibile tra i valori di misura più alti e quelli più bassi (fig. 8).
Tutti i lettori di micropiastre BMG LABTECH determinano automaticamente il gain, a condizione che venga identificato un pozzetto specifico con una determinata intensità di segnale. Tuttavia, sui modelli CLARIOstarPlus e VANTAstar non ènecessario regolare il guadagno. La tecnologia EDR (Enhanced Dynamic Range) è stata specificamente progettata per offrire la più ampia gamma dinamica possibile - 8 decadi di concentrazione. Ciò offre ai ricercatori una comodità senza precedenti nelle misure su micropiastra, in quanto è possibile misurare risultati altamente affidabili su un ampio intervallo dinamico senza alcun intervento manuale.
Altezza focale
L'altezza a cui viene rilevato il segnale ha un impatto significativo sulla sensibilità della misura. La misurazione a un'altezza focale non ottimale può ridurre il segnale fino al 90%. Ad esempio, le cellule fluorescenti aderenti devono essere misurate vicino al fondo della piastra, mentre una soluzione fluorescente omogenea dà il segnale più alto appena sotto la superficie del liquido e dipende dal volume di riempimento del pozzetto. Alcuni lettori di piastre determinano l'altezza focale ottimale in un pozzetto selezionato. CLARIOstar® Plus e VANTAstar® vannooltre e determinano automaticamente l'altezza focale durante la lettura della piastra.
Saggi in fluorescenza - A cosa serve l'intensità della fluorescenza?
Il numero di saggi di fluorescenza è tanto grande quanto il numero di domande biologiche e chimiche a cui possono rispondere. Di seguito sono descritte le applicazioni più comuni basate sull'intensità di fluorescenza.
Saggi di vitalità cellulare e citotossicità
Se le cellule sono danneggiate da un composto o se le cellule tumorali muoiono dopo il trattamento sono domande comuni a cui rispondono i saggi di vitalità e citotossicità fluorescenti e i lettori di micropiastre. Nelsaggio alamarBlue™, la resazurina viene ridotta dalle cellule metabolicamente attive a un fluoroforo e fornisce informazioni sulla vitalità cellulare. Un altro modo per valutare la vitalità cellulare è l'incorporazione nel DNA di nucleosidi marcati in modo fluorescente. Questi vengono incorporati e di conseguenza fluorescono solo se avviene la replicazione del DNA, un marcatore di vitalità.
Un modo per rilevare la morte cellulare in base all'intensità della fluorescenza si basa su coloranti fluorescenti del DNA come SYBR® Greeno Celltox™ Green. I coloranti non sono permeabili alla cellula, ma vengono esposti al DNA in soluzione nel caso in cui la membrana cellulare venga interrotta durante la morte cellulare e quindi iniziano a fluorescere (fig. 9). Questi saggi sono compatibili con le misurazioni in tempo reale e possono monitorare la salute delle cellule nel tempo. Poiché queste misurazioni vengono effettuate per giorni, la camera per micropiastre deve essere incubata a 37 °C e con il 5% di CO2 permantenere le cellule in buona salute. Il CLARIOstar Plus con unità di controllo atmosferico hadimostrato di fornire l'atmosfera ideale per esperimenti a lungo termine basati sulle cellule. Altri saggi sulla salute delle cellule sono descritti nel nostro blog post "Saggi di vitalità cellulare - Misurate quanto sono felici le vostre cellule".
Saggi di attività enzimatica
Poiché gli enzimi sono coinvolti in molteplici processi biologici, è importante studiare come gli inibitori o i promotori influenzino le attività enzimatiche. I principi dei saggi enzimatici sono analoghi: utilizzano un substrato pre-fluorescente che, al momento dell'elaborazione enzimatica, rilascia un fluoroforo. I fluorofori più comuni sono basati su derivati della cumarina, come nelsaggio basato sulla fluorescenza dell'enzima epigenetico istone deacetilasi 1 (HDAC1), dove possono essere utilizzati per studiare l'inibizione delle istone deacetilasi.
Un secondo fluoroforo utilizzato nei saggi enzimatici è il 4-metilumbelliferone. Un esempio è riportato nella nota applicativa "CLARIOstar determina l'attività di un'alfa-glucosidasi acida umana prodotta dal muschio (GAA) in un saggio basato sulla fluorescenza". Illettore di micropiastremultimodale CLARIOstarPlus semplifica l'analisi dell'attività enzimatica in fluorescenza. La tecnologia Enhanced Dynamic Range consente la lettura in un intervallo dinamico di 8 decadi. In questo modo, l'aumento del segnale nelle analisi dell'attività enzimatica viene facilmente registrato senza il rischio di scegliere un guadagno sbagliato o di dover ottimizzare lo strumento. Lo strumento viene fornito con un software di analisi gratuito con analisi cinetica enzimatica integrata che copre la modellazione di Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk(misure cinetiche enzimatiche eseguite su un lettore di micropiastre BMG LABTECH).
Cambiamenti conformazionali: ripiegamento e dispiegamento delle proteine
La fluorescenza degli amminoacidi presenti in natura, come il triptofano, può essere utilizzata anche per misurare i cambiamenti conformazionali e l'attività enzimatica delle proteine. Alcuni esempi di applicazioni sono descritti nel nostro blog post La fluorescenza del triptofano: la sonda della natura. La fluorescenza del triptofano è utile, ad esempio, per lo screening di nuovi terapici per bersagli farmacologici come i recettori accoppiati a proteine G, uno dei bersagli più popolari per i farmaci approvati oggi sul mercato.
Saggi di aggregazione proteica
Le proteine si aggregano se sono mal ripiegate e l'aggregazione è correlata a malattie come l'Alzheimer, il Parkinson e la malattia da prioni. L'analisi della formazione di aggregati molecolari aiuta a diagnosticare e comprendere queste malattie e a testare potenziali farmaci. I due fluorofori bis-ANS e tioflavina T (ThT) aumentano la loro intensità di fluorescenza quando interagiscono con gli aggregati proteici. Il bis-ANS interagisce preferibilmente con gli aggregati amorfi, come descritto nella nota applicativa "Uso di un lettore di micropiastre BMG LABTECH per monitorare la formazione di amiloidi".
Il ThT si lega alle fibrille e viene utilizzato principalmente nei saggi cinetici. Se il campione contiene molecole che inducono l'aggregazione, le proteine ricombinanti si aggregano e la fluorescenza aumenta (fig. 10).
La nota applicativa "Real-time quaking-induced conversion assay for prion seeding" spiega come il saggio viene utilizzato per rilevare la malattia prionica scrapie negli omogenati di cervello di criceto. Poiché questi saggi di aggregazione richiedono un'agitazione prolungata, i lettori di micropiastre di BMG LABTECH possono essere dotati di sistemi di trasporto molto robusti e durevoli.
