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¿Qué es la absorbancia?
En general, la absorbancia es un proceso en el que la luz interactúa con la materia. Cuando la luz incide sobre algo que absorbe parte de la luz, hablamos de absorbancia. Por supuesto, la luz absorbida no se pierde, sino que se transforma en calor o energía química al excitarse la molécula absorbente. La absorbancia es un proceso físico con el que nos encontramos todos los días cuando vemos los colores: La luz blanca, como la luz del sol, contiene todos los colores de la luz visible. Cuando incide sobre la hierba verde, ésta absorbe todos los colores menos el verde. La luz verde se reemite y es lo que da color a la hierba.
Antecedentes teóricos de las mediciones de absorbancia
Trayectoria de detección en cubetas y microplacas
Tradicionalmente, las mediciones de absorbancia se realizaban en una cubeta: Se coloca en una cubeta una solución con un analito de características de absorbancia conocidas. A continuación, un lector de absorbancia determina la absorbancia enviando luz con intensidad conocida a través de la muestra y detectando la intensidad detrás de la muestra. La luz que no llega al detector se absorbe o se dispersa. La parte dispersa se determina por separado midiendo los blancos apropiados y se resta de este valor para obtener la absorbancia pura de la sustancia de interés.
Resultado de las mediciones de absorbancia: transmisión, absorbancia y densidad óptica
La parte de la luz que es capaz de atravesar la muestra también se denomina transmisión y se expresa principalmente en porcentaje (Fig. 2). Cuanto más analito se encuentra en la solución, más luz es absorbida por él y menor es la transmisión. La absorbancia, sin embargo, es la parte de la luz absorbida por el analito. Es el valor absoluto del logaritmo (a la potencia de 10) de la transmisión1. Aquí están las ecuaciones matemáticas y algunos números para explicar lo que se describe por transmisión y absorbancia:
Transmisión: T =Iout /Iin
Absorbancia: A =-log10T
Tabla 1: Ejemplos de transmisión y según los valores de absorbancia
| Transmisión | Absorbancia |
| 0,1 (o 10%) | 1 OD |
| 0,01 (o 1%) | 2 DO |
| 0,001 (o 0,1%) | 3 OD |
Absorbancia en química y ciencias de la vida - cuantificar una sustancia en solución
Tras realizar una medida de absorbancia, el resultado es un valor dado en transmisión o densidad óptica. Sin embargo, si el objetivo de la medición es la cuantificación de una sustancia en solución, la pregunta obvia es cómo convertir la señal en el valor de concentración. En general, hay dos maneras: empleando la ley de Beer-Lambert o midiendo una curva estándar en paralelo a muestras de concentraciones desconocidas.
Ley de Beer-Lambert
La ley de Beer-Lambert describe la relación entre la absorbancia, la longitud del trayecto y la concentración de una sustancia absorbente:
A=c*d*ε
Cambiado a c: c=A/(d*ε)
Ley de Beer-Lambert con A - absorbancia, c - concentración, d - longitud del camino, ε - coeficiente de extinción.
Dice que la absorbancia es lineal a la concentración multiplicada por la longitud del camino y el coeficiente de extinción2. La longitud del camino se refiere a la longitud de la muestra que debe atravesar la luz. Por ejemplo, en una cubeta el recorrido está normalizado a 1 cm. El coeficiente de extinción es una constante específica para una sustancia absorbente y una longitud de onda concreta, normalmente el máximo de absorbancia de la sustancia. Proporciona información sobre la intensidad con la que la sustancia específica absorbe la luz en la longitud de onda específica. Por ejemplo, el coeficiente de extinción de masa de la albúmina de suero bovino (BSA) es de 0,67 µl*cm-1*µg-1. Por consiguiente, una solución de 1 µg/µl de BSA con una longitud de camino de 1 cm tiene una absorbancia de 0,67 OD.
La ley de Beer-Lambert es muy útil, ya que permite cuantificar las sustancias absorbentes sin necesidad de añadir ningún otro reactivo. Sin embargo, está limitada como se indica a continuación.
La ley de Beer-Lambert sólo puede utilizarse si
- El analito absorbe la luz a una longitud de onda específica
- Se conoce la longitud del camino
- Se conoce el coeficiente de extinción del analito
- La absorbancia de los reactivos tampón no se solapa con la absorbancia del analito.
Utilización de una curva estándar
Si alguno de estos criterios no se aplica, existe la posibilidad de medir indirectamente los analitos y/o utilizar una curva estándar. Por ejemplo, los ensayos colorimétricos de cuantificación de proteínas, como el ensayo de Bradford, dependen de una sustancia que aumenta la absorbancia en presencia de proteínas. El aumento se mide en una curva estándar con concentraciones conocidas de proteínas, así como en muestras, de modo que se puede calcular su concentración.
¿Cómo se detecta la absorbancia?
Fuente de luz
Se explica por sí mismo: la medición de la transmisión/absorción de la luz requiere en primer lugar luz. Para medir la absorbancia se pueden utilizar diferentes fuentes de luz. Se diferencian en el rango espectral que cubren, en su intensidad y en la estabilidad de la luz que emiten.
Las lámparas halógenas de tungsteno cubren la gama de 360 nm a más de 1000 nm y se utilizan a menudo debido a su rentabilidad. Las lámparas de xenón, sin embargo, cubren la región espectral de 220 nm a 1000 nm y abarcan el rango UV del espectro. Esto hace posible la detección y cuantificación de ácidos nucleicos (260 nm) y proteínas (280 nm). Los lectores de microplacas de absorbancia de BMG LABTECH están equipados con una lámpara de flash de xenón para mediciones de absorbancia y, por lo tanto, proporcionan la máxima flexibilidad para medir cualquier longitud de onda entre 220 y 1000 nm, o todo el espectro de longitudes de onda.
Muestra
Los líquidos de interés deben transferirse a una cubeta o a una microplaca para medir su absorbancia. El material de la cubeta y de la microplaca es siempre transparente para garantizar la máxima transmisión de la luz, ya que lo que interesa al investigador es la absorbancia de la solución y no del material. Aún así, existen varios materiales comunes que difieren de unos a otros. El poliestireno es el más utilizado y puede alterarse para proporcionar características de unión específicas, ya sea para aplicaciones de cultivo celular o ELISA. Sin embargo, no son transmisivos en el rango UV, lo que requiere el uso de placas especiales de copolímero de olefina cíclica para medir la absorbancia por debajo de 400 nm.
Volumen de la muestra
Un segundo aspecto a tener en cuenta es el volumen de muestra necesario para realizar mediciones de absorbancia fiables. Las cubetas estándar requieren aproximadamente 4,5 ml, mientras que las de semimicrovolumen permiten reducir el volumen hasta 1,5 ml y las de microvolumen se arreglan con 70 µl. La medición con cubetas es horizontal: la luz se dirige desde un lado a la muestra y en el lado opuesto se detecta la luz transmitida. Por lo tanto, la geometría de las cubetas proporciona una longitud de trayectoria normalizada de 1 cm. Esta es una de las principales diferencias con las mediciones en microplacas, ya que se realizan verticalmente (de arriba a abajo o de abajo a arriba). En consecuencia, la longitud del trayecto también cambia con el volumen de la muestra y requiere el uso de volúmenes iguales para un experimento. Además, los efectos del menisco desempeñan un papel importante en la longitud del trayecto en las mediciones de absorbancia en microplacas, como se explica detalladamente en la Nota práctica: Cómo tratar la longitud del trayecto y el menisco en microplacas. Las mediciones realizadas en el centro del pocillo de una microplaca tienen un trayecto mucho más corto en presencia de un menisco fuerte en comparación con una medición sin menisco. Esto tiene una importancia específica cuando se aplica Beer-Lambert o cuando hay meniscos muy variables en un experimento. En soluciones acuosas es posible corregir los cambios de longitud de trayecto dependientes del menisco aprovechando la absorbancia del agua(corrección de la longitud de trayecto del pico de agua).
Normalmente se utilizan placas estándar de 96 pocillos con volúmenes de muestra que oscilan entre 100 y 300 µl, lo que se traduce en una longitud de trayectoria aproximada de 2,9 a 7,4 mm. Puede ser necesario reducir aún más el volumen de la preciada muestra sin comprometer la longitud del trayecto. Para ello, pueden utilizarse placas de media área o placas de mayor densidad. Proporcionan un área de pocillos más pequeña pero la misma altura que las placas estándar de 96 pocillos y, por lo tanto, proporcionan longitudes de trayecto elevadas con volúmenes más bajos.
El blanco adecuado
Para corregir las mediciones de absorbancia de la absorbancia no deseada de los componentes del tampón, de la placa y de los efectos de la dispersión de la luz, se mide un blanco en paralelo a las muestras. El blanco apropiado contiene todos los componentes del ensayo excepto el analito. Por el contrario, un blanco de PBS o de agua suele ser insuficiente.
Debe prestarse especial atención a las partículas que se encuentran en las muestras analizadas y en los blancos. Las partículas dispersan la luz y aumentan el valor de absorbancia medido, ya que llega menos luz al detector. Cuando las partículas se mueven en la solución, se detectan cuando bloquean el paso de la luz. Cuando se mueven fuera de la trayectoria de detección no se miden. Este fenómeno aumenta la variabilidad de los datos de absorbancia. Si no es posible eliminar las partículas de las soluciones medidas, se recomienda cubrir un área mayor del pocillo de la microplaca en la medición de absorbancia, una característica que ofrecen todos los dispositivos BMG LABTECH para las mediciones de absorbancia.
Detector de mediciones de absorbancia
Una vez que la luz transmitida ha atravesado la muestra, es necesario detectarla. En los lectores de microplacas se suelen utilizar dos tipos diferentes de detectores: un tubo fotomultiplicador (PMT) o un espectrómetro CCD. Los sistemas basados en PMT requieren la selección de la longitud de onda antes de la detección. Esto se hace mediante filtros ópticos o monocromadores que seleccionan la longitud de onda deseada antes de ser guiada a la muestra. La luz transmitida de la longitud de onda deseada llega entonces al PMT. El PMT amplifica la señal de la luz transmitida y da lugar a un voltaje indicativo de su intensidad. Para explorar la absorbancia en un rango de longitudes de onda, los sistemas basados en PMT utilizan un monocromador que selecciona la longitud de onda deseada para cada punto del espectro y las mide secuencialmente.
Esta es la principal diferencia con el segundo tipo de detectores de absorbancia, el espectrómetro. Éste divide la luz transmitida en diferentes longitudes de onda y éstas se dirigen a un detector CCD, captando la intensidad de todas las longitudes de onda a la vez. De este modo, tanto los espectros como las mediciones de una o pocas longitudes de onda pueden adquirirse en un tiempo similar. Por ejemplo, los instrumentos de BMG LABTECH emplean espectrómetros UV/vis para mediciones de absorbancia que capturan un espectro completo (220 1000 nm) en menos de un segundo.
