Nefelometria

Che cos'è la nefelometria?

La nefelometria (dal greco nephelo: nuvola) è una tecnica di chimica analitica utilizzata per misurare la quantità di torbidità o nuvolosità di una soluzione causata dalla presenza di particelle insolubili in sospensione.

Quando viene diretta attraverso una soluzione torbida contenente particelle solide in sospensione, la luce viene trasmessa, assorbita (bloccata) e diffusa (riflessa dalle particelle; fig. 1). La quantità di luce diffusa dipende dalle dimensioni, dalla forma e dalla concentrazione delle particelle insolubili nella soluzione, nonché dalla lunghezza d'onda della luce incidente.Le teorie e i concetti sulla diffusione della luce sono stati intrapresi alla fine del XIX e all'inizio del XX secolo, principalmente da Rayleigh, Mie e Debye.

La nefelometria è stata applicata per la prima volta nel campo della chimica clinica ai test immunologici per la rilevazione e la quantificazione delle proteine del siero nel sangue, come le immunoglobuline e le macromolecole. Queste applicazioni sono ancora in uso oggi. Applicate ai lettori di micropiastre, sono utilizzate principalmente per analizzare la precipitazione dei materiali (fig. 2), come la solubilità dei farmaci e l'aggregazione delle proteine, o la crescita batterica.

Differenza tra nefelometria e turbidimetria

La torbidità o la torbidezza possono essere rilevate con la nefelometria o con la turbidimetria. Entrambe le tecniche non sono distruttive e si basano sulla diffusione della luce causata da una sospensione di particelle solide. Sebbene questi due termini siano talvolta usati come sinonimi, tecnicamente non lo sono. La torbidimetria è il processo di misurazione della perdita di intensità della luce trasmessa attraverso un campione causata dall'effetto di diffusione delle particelle insolubili. Analogamente all'assorbanza, la turbidimetria quantifica l'intensità della luce trasmessa attraverso il campione, in particolare la sua attenuazione. Nella torbidimetria, la luce di lunghezza d'onda nota viene fatta passare attraverso un campione contenente particelle insolubili in soluzione. Un rilevatore posto in linea con la sorgente luminosa raccoglie la luce che passa attraverso il campione (fig. 3A). La diminuzione della trasmissione della luce viene misurata rispetto a un riferimento e la luce assorbita viene quantificata come unità di densità ottica (OD).² Di conseguenza, la torbidità può essere misurata, ad esempio, con un lettore di micropiastre ad assorbanza.

La nefelometria, invece, determina la torbidità di una soluzione quantificando direttamente l'intensità della luce diffusa dalle particelle insolubili presenti nel campione. Di solito, la luce diffusa viene misurata con un angolo rispetto alla sorgente luminosa incidente, per evitare l'interferenza della luce eventualmente trasmessa (fig. 3B). A questo proposito, condivide analogie con la misurazione dell'intensità della fluorescenza.

Nefelometria vs turbidimetria

Quando si eseguono saggi di dispersione della luce, la scelta tra nefelometria e turbidimetria è dettata principalmente da due fattori.

• Il fattore più rilevante èla concentrazione del campione e laconseguente intensità della luce diffusa rispetto all'intensità della sorgente luminosa. Se il campione contiene un numero ridotto di particelle insolubili (basse concentrazioni), l'intensità della luce trasmessa sarà approssimativamente paragonabile all'intensità della sorgente luminosa. In questo caso, la nefelometria è una scelta più appropriata. Come nell'assorbimento molecolare, una piccola differenza tra due segnali intensi può essere difficilmente determinata, la turbidimetria è più adatta quando i campioni contengono un'alta concentrazione di particelle insolubili e quindi la trasmissione della luce è significativamente ridotta.

• La dimensione delle particelle diffondenti èil secondo parametro da considerare, poiché influisce sulla quantità di luce riflessa (bloccata) o diffusa. La riflessione avviene quando le dimensioni delle particelle sono maggiori della lunghezza d'onda della luce incidente. Se le dimensioni delle particelle sono paragonabili o inferiori alla lunghezza d'onda incidente, si verifica la dispersione. Di conseguenza, la nefelometria è più adatta a rilevare particelle di piccole dimensioni, con 0,1 - 1 μm come dimensione ottimale, poiché la diffusione predomina sulla riflessione. Le dimensioni delle particelle sono meno importanti per la turbidimetria, poiché viene rilevata la diminuzione relativa della trasmissione della luce. Infatti, la rilevazione turbidimetrica è ancora possibile anche quando le particelle di grandi dimensioni determinano un aumento della riflessione o della rifrazione.

Di conseguenza, la nefelometria è più adatta e offre una maggiore sensibilità per l'analisi di piccole particelle in sospensione a basse concentrazioni. La torbidimetria viene solitamente applicata a particelle insolubili relativamente grandi e ad alte concentrazioni. Ad esempio, è comunemente utilizzata in biologia per determinare il numero di cellule (ad esempio, batteri) in una soluzione. ³

Principio della nefelometria

La diffusione della luce nei liquidi segue le regole della diffusione elastica della fisica delle particelle, in cui nessuna energia viene assorbita da entrambe le particelle durante la "collisione". L'energia di un fotone prima e dopo l'evento di scattering non cambia. La diffusione elastica è diversa nelle particelle grandi e piccole. Per le particelle grandi, la luce viene diffusa principalmente nella direzione di avanzamento (forward-angled). Quando le dimensioni delle particelle sono inferiori al 5% della lunghezza d'onda della luce che le colpisce, la diffusione è distribuita simmetricamente.⁴

Le molecole solubili sono generalmente di piccole dimensioni (rispetto alle lunghezze d'onda della luce incidente) e si diffondono in modo quasi simmetrico (fig. 4A). Al contrario, i precipitati e i complessi in soluzione hanno in genere dimensioni maggiori (più vicine alle lunghezze d'onda della luce incidente) e producono prevalentemente una dispersione ad angolo in avanti (fig. 4B). La rilevazione nefelometrica si concentra tipicamente sulla misurazione della dispersione in avanti.

Diffusione e concentrazione delle particelle

L'intensità della luce diffusa (I_S) e la concentrazione del precipitato (C) sono correlate dalla seguente equazione:

I_S=k_S*I₀* C

dove k_S èuna costante determinata dalla calibrazione del sistema e I₀ èl'intensità alla sorgente luminosa.

Le proprietà fisiche di una sospensione di particelle sono influenzate da diverse variabili. Sebbene la diffusione sia legata alla concentrazione delle particelle solide in soluzione, l'intensità della luce diffusa dipende anche dalla loro dimensione e forma. Campioni ugualmente concentrati contenenti precipitati di dimensioni diverse mostreranno livelli di diffusione diversi.

Inoltre, le dimensioni e la forma dei precipitati sono influenzate dalla temperatura, dal pH e dalla concentrazione dei reagenti, nonché dall'ordine di miscelazione e agitazione e dall'intervallo tra la formazione del precipitato e la rilevazione. Per ottenere condizioni e risultati riproducibili tra i campioni e i test, è necessario considerare tutte queste diverse variabili.^4,5

Lunghezza d'onda della sorgente luminosa

La selezione della lunghezza d'onda è solitamente irrilevante, poiché l'assorbimento della luce incidente da parte delle particelle in sospensione non viene generalmente considerato, purché non induca la fluorescenza del campione. Pertanto, se si utilizzano campioni non fluorescenti, non è necessaria una selezione specifica della lunghezza d'onda. La scelta della lunghezza d'onda si basa principalmente sulla necessità di minimizzare le potenziali interferenze e influisce piuttosto sull'intensità della luce incidente o della diffusione stessa.⁴

Strumentazione per nefelometria: come si rileva?

Sebbene i fluorometri possano essere utilizzati per la rilevazione nefelometrica, la dipendenza angolare dello scattering ha incoraggiato lo sviluppo di dispositivi dedicati. I torbidimetri con rilevatori posizionati ad angolo rispetto al fascio incidente sono chiamati nefelometri e sono considerati lo strumento standard per la misurazione di bassi valori di torbidità. Misurano l'intensità della luce diffusa. La luce trasmessa non viene rilevata.

I componenti di base di questo dispositivo comprendono una sorgente luminosa, un'ottica di diffusione della luce e un rilevatore. La sorgente luminosa genera un fascio che viene diretto attraverso il campione. Come sorgenti luminose si possono utilizzare lampade alogene e allo xeno o laser. I laser sono in genere la scelta più comune, grazie alla loro sensibilità, all'elevata intensità e alla natura coerente (i fotoni emessi sono "al passo" tra loro). Le lunghezze d'onda in entrata e in uscita sono identiche e quindi non sono selezionate otticamente.

Un rilevatore è posto di fronte alla sorgente luminosa e ad un angolo rispetto al fascio di luce in entrata. A seconda della sua posizione, rileva le variazioni della dispersione in avanti o della dispersione laterale. A seconda dell'angolo in cui è possibile raccogliere la maggior parte della dispersione, i rivelatori possono essere posizionati ad angoli di 30°, 70° o 90°.

La nefelometria può essere condotta come misura endpoint o cinetica. Le misurazioni endpoint quantificano la massima dispersione di luce dopo che la reazione ha raggiunto l'equilibrio o in un momento prestabilito. La rilevazione cinetica (letture multiple nel tempo) può essere applicata durante l'intero processo di precipitazione e di solito fornisce maggiori informazioni sulla reazione.

Applicazione della nefelometria

Dagli anni '70 l'immunofelometria è stata applicata nei laboratori clinici per l'analisi degli immunodosaggi. Inizialmente è stata utilizzata per rilevare la formazione e la precipitazione di immunocomplessi (antigene-anticorpo), un'applicazione tuttora in uso. L'immunonefelometria viene utilizzata anche per determinare la concentrazione delle proteine del siero, comprese le immunoglobuline, nonché nei coagulometri automatici ad alto volume. Questi dispositivi quantificano i fattori di coagulazione nei campioni di sangue e consentono di ottenere profili di coagulazione a test multipli.

Nei laboratori farmaceutici, la nefelometria viene utilizzata principalmente per valutare la solubilità di farmaci o composti. Inoltre, è un metodo promettente per la quantificazione della crescita microbica ed è comunemente utilizzata per determinare la conta cellulare di sospensioni di microrganismi come il lievito (ad es. S. cerevisiae).⁶

Nefelometria su micropiastra

La nefelometria può essere rilevata anche in micropiastre (fig. 5). Questo formato è particolarmente vantaggioso per i laboratori di scienze biologiche e per l'industria farmaceutica, poiché la gestione dei campioni e dei composti basata su micropiastre aumenta l'efficienza e la produttività.I nefelometri basati su micropiastre offrono solitamenteuna maggiore produttività, un approccio semplificato e a basso volume per la raccolta di dati sulla torbidità.Il primo dispositivo di rilevamento nefelometrico al mondo basato su laser in micropiastre, il NEPHELOstarPlus, è stato sviluppato da BMGLABTECH. Questo strumento rileva le particelle in soluzione in un pozzetto di micropiastra misurando la luce diffusa in avanti generata quando un raggio laser viene diretto attraverso il campione.

Come sorgente luminosa, un diodo laser altamente collimato offre intensità e diametro del fascio regolabili. Queste caratteristiche riducono i problemi di menisco e ottimizzano la sensibilità, consentendo di effettuare misure in formati di piastre da 384 pozzetti.

Nel NEPHELOstar Plus, il raggio laser passa attraverso il pozzetto del campione in una sfera di Ulbricht (sfera integratrice) posizionata sotto la micropiastra. Questa sfera raccoglie la luce diffusa incidente su qualsiasi punto della sua superficie interna e la distribuisce equamente a tutti gli altri punti mediante riflessioni multiple. La sfera di Ulbricht raccoglie la luce diffusa fino a un angolo di 80°, ne conserva l'intensità ma minimizza gli angoli di diffusione originali, eliminando così l'informazione spaziale e producendo una luce diffusa che può essere quantificata dal rivelatore (fig. 6).

Se il fascio di luce non viene deviato dai precipitati presenti nel pozzetto, passa direttamente attraverso la sfera di Ulbricht, non si verifica alcuna riflessione e, di conseguenza, nessun segnale raggiunge il rivelatore. Se nel campione sono presenti particelle, la luce viene diffusa, riflessa all'interno della sfera di Ulbricht e infine misurata da un rivelatore posizionato con un angolo di 90° rispetto alla luce incidente (fig. 7).

La torbidità è spesso espressa in NTU (Nephelometric Turbidity Units), soprattutto nei test sulla qualità dell'acqua. I valori NTU possono essere ricavati da uno strumento calibrato sulla base di misurazioni comparative con sospensioni di formazina di riferimento. Tuttavia, si tratta di un processo lungo e a più fasi che richiede grandi volumi di campione. Il NEPHELOstar Plus quantifica i risultati in unità nefelometriche relative (RNU). Il modo in cui le NTU possono essere confrontate con le RNU è descritto nella nota applicativa "Improving throughput for assessing nephelometric turbidity units (NTUs) using the NEPHELOstar Plus". La correlazione tra i due approcci è illustrata nella Figura 8.

Qualità delle micropiastre

Di solito, i saggi nefelometrici vengono eseguiti in micropiastre da 96 o 384 pozzetti. La qualità ottica di una micropiastra è un aspetto estremamente importante. Imperfezioni come polvere, sporcizia, impronte digitali o graffi sul fondo del pozzetto possono diffondere la luce, generando segnali falsi positivi, riducendo la finestra del saggio o portando a una sensibilità significativamente ridotta. Pertanto, i pozzetti con valori particolarmente elevati o con valori superiori alla media del bianco più due deviazioni standard non dovrebbero essere presi in considerazione.⁷

Applicazioni della nefelometria su micropiastra

La nefelometria su micropiastra è uno strumento prezioso per l'industria farmaceutica grazie alla sua applicabilità negli screening di solubilità dei composti ad alta produttività. Inoltre, può essere utilizzata per la crescita microbica e la cinetica di legame delle proteine, per misurare la propensione alla calcificazione nei fluidi corporei, i fattori reumatoidi nel siero, il legame antigene-anticorpo (fig. 9) e molto altro ancora.

Saggi di solubilità dei farmaci

Nell'industria farmaceutica, lo screening ad alto rendimento è un metodo importante per la scoperta di farmaci. La valutazione della solubilità in questo processo è obbligatoria per determinare la validità dei risultati farmacologici e la selezione di composti promettenti. La solubilità dei farmaci ha un impatto importante sulla disponibilità, la formulazione, il dosaggio e l'assorbimento dei farmaci. Per questo motivo, è molto importante analizzarla fin dalle prime fasi del processo di scoperta dei farmaci, per evitare di sottoporre a screening ADME costosi e dispendiosi composti a bassa solubilità.

Tradizionalmente, i saggi di solubilità all'equilibrio sono stati determinati in modo limitato, agitando e incubando il composto con un solvente per almeno 24 ore, prima della filtrazione e della determinazione della concentrazione mediante HPLC. Questo approccio non soddisfa più i requisiti della moderna scoperta di farmaci.

Oggi, gli schermi cinetici di solubilità automatizzati eseguitisu nefelometri a micropiastra offrono una maggiore produttività in tempi più brevi. In questo approccio, una diluizione seriale del composto da testare viene preparata in una soluzione acquosa e pipettata su una micropiastra. Il precipitato non disciolto viene rilevato mediante diffusione della luce. Ad alte concentrazioni, il composto precipita rendendo la sospensione torbida e fornendo un'elevata conta di RNU. Finché la concentrazione è superiore alla solubilità, il composto precipita. Quando la concentrazione è inferiore alla solubilità, il composto si scioglie completamente dando luogo a una soluzione limpida. Di conseguenza, la dispersione e il conteggio delle RNU si ridurranno in modo significativo. In genere, ai dati vengono applicati due raccordi lineari per le fasi solubile e insolubile. Il punto in cui si incrociano è considerato il punto di solubilità cinetica (fig. 10).

I vantaggi di questo approccio sono la velocità del dosaggio e la facilità di manipolazione. I saggi nefelometrici basati su micropiastre richiedono solo fasi di pipettaggio; non è necessaria la filtrazione o la separazione di fase della soluzione dal residuo non disciolto. Inoltre, non è necessaria alcuna fase di trasferimento del liquido, poiché l'impostazione del saggio e la sua misurazione possono essere eseguiti nella stessa micropiastra. Infine, può essere utilizzato per determinare sia la concentrazione alla quale un composto diventa solubile sia il punto in cui un soluto inizia a precipitare.

In genere, il segnale rilevato è lineare fino a 3 ordini di grandezza della concentrazione delle particelle e per i saggi di solubilità cinetica si può raggiungere un limite di rilevazione di circa 20 mmol/L.⁸

Crescita microbica

La nefelometria basata su micropiastre può essere utilizzata anche come alternativa al rilevamento della crescita microbica basato sull'assorbanza OD600.. Con la moltiplicazione dei batteri, aumenta il numero di cellule che fluttuano nella soluzione, aumentando così i livelli di dispersione e la conta delle RNU. In genere si utilizza una diluizione seriale della coltura per mettere in relazione la densità ottica con la conta delle RNU. L'approccio nefelometrico è paragonabile a quello basato sull'assorbanza, ma di solito ha una sensibilità maggiore.

Le note applicative Monitoraggio delle curve di crescita microbica mediante nefelometria laser e Monitoraggio nefelometrico della crescita di Candida albicans(fig. 11) mostrano come le curve di crescita possano essere misurate in modo efficiente con NEPHELOstarPlus.