Intensidad de fluorescencia (incl. FRET)

¿Qué es la intensidad de fluorescencia?

La fluorescencia se basa en la fotoluminiscencia, un proceso de resplandor y emisión de luz. Se trata de un proceso físico en el que la luz se emite después de haber sido absorbida por una sustancia. La intensidad de la fluorescencia indica cuánta luz (fotones) se emite. Es la magnitud de la emisión y depende de la concentración del fluoróforo excitado.

La fluorescencia se crea por la absorción de energía (luz) por moléculas fluorescentes, llamadas fluoróforos. La energía absorbida eleva los electrones a un nivel de energía superior. Como este estado de excitación es inestable, los electrones vuelven al estado básico y emiten luz (fig. 1).

Una parte menor de los fotones absorbidos se convierte en movimiento y calor. Así, la energía que se libera cuando los electrones retroceden es siempre menor que la energía necesaria para excitar el electrón. Dado que la radiación de onda superior es menos energética que la de onda corta, la emisión tiene siempre una longitud de onda superior a la de la luz que se utilizó para la excitación. La distancia entre los máximos de excitación y emisión (picos) se denomina desplazamiento de Stokes (fig. 2).¹

Detección de la intensidad de fluorescencia

Aunque los fluoróforos difieren entre sí, la base de las mediciones de intensidad de fluorescencia en microplacas es la misma (fig. 4):

• Una fuente de luz produce luz de banda ancha
• La gama de longitudes de onda de excitación se filtra a partir de la luz de banda ancha
• La gama de longitudes de onda de excitación excita el fluoróforo
• El rango de longitud de onda de emisión se filtra a partir de la luz de emisión
• Un detector cuantifica la luz de emisión filtrada

A diferencia de la absorbancia, la fluorescencia no es una medida absoluta. La intensidad de la señal fluorescente suele ser relativa a otras mediciones o a una medición de referencia realizada por un instrumento. En consecuencia, loslectores de placas de fluorescencia miden la señal luminosa emitida por una muestra en unidades fluorescentes relativas (RFU).

Fuentes de luz

Existen tres fuentes de luz de uso común en los lectores de microplacas. Independientemente de la fuente de luz con la que esté equipado su lector, su rendimiento puede afectar a los resultados de la medición. Obtenga más información en la Nota práctica: ¿Cómo influye el número de destellos en los resultados de las mediciones?

Lámpara de flash de xenón

Las lámparas de flash de xenón emitenluz en el rango de 200 nm a 2500 nm. Por lo tanto, son adecuadas para excitar cualquier molécula que absorba luz desde el rango UV hasta el rango infrarrojo. Presentan un alto rendimiento de señal y son de larga duración. Debido a estas ventajas, las lámparas de flash de xenón se utilizan como fuentes de excitación de fluorescencia en los lectores de placas de BMG LABTECH.

Lámpara halógena de tungsteno

Las lámparas halógenas emiten luz a partir de aproximadamente 360 nm y no son adecuadas para medir la intensidad de fluorescencia UV. En comparación con las lámparas de xenón, las lámparas de tungsteno tienen una vida útil más corta, una intensidad de salida más baja y dan lugar a una menor sensibilidad, si se utilizan en la detección de fluorescencia en lectores de microplacas.

LEDs

Los diodos emisores de luz (LED) emiten luz con gran intensidad, pero sólo en un ancho de banda específico. En consecuencia, se requieren múltiples diodos para diferentes longitudes de onda de excitación, lo que complica y encarece la detección flexible de múltiples fluoróforos.

Selección de la longitud de onda

Las fuentes de excitación de banda ancha pueden abarcar amplios rangos de longitud de onda, desde la luz ultravioleta hasta la infrarroja. Para excitar específicamente el fluoróforo de interés y evitar señales inespecíficas, la luz de excitación de banda ancha debe seleccionarse (filtrarse) para transmitir sólo luz en torno al máximo de excitación del fluoróforo. Del mismo modo, la luz de emisión se filtra para el máximo de emisión del fluoróforo. De este modo, sólo la fluorescencia procedente del fluoróforo de interés es guiada hasta el detector. En consecuencia, la sensibilidad del ensayo se mejora optimizando el rango de longitudes de onda.

La sensibilidad de detección en algunos lectores de microplacas de intensidad de fluorescencia se mejora mediante el uso de una selección adicional entre excitación y emisión: unespejo dicroico. El espejo dicroico suele transmitir la luz superior a una longitud de onda específica, pero bloquea la luz de longitudes de onda inferiores. El corte se sitúa entre la excitación y la emisión y proporciona una menor fuga de luz de excitación al detector.

Filtros

Losfiltros ópticos sonfinos portaobjetos de vidrio redondos o rectangulares con un revestimiento óptico. El revestimiento sólo transmite la luz de una determinada longitud de onda. Los fluoróforos con diferentes máximos de excitación y emisión necesitan filtros diferentes. Un filtro suele llevar el nombre de la longitud de onda de transmisión media, que suele ser el máximo de excitación o emisión del fluoróforo. Además, un filtro óptico tiene un ancho de banda definido (o paso de banda), que indica la amplitud del rango de transmisión. Por ejemplo, un filtro de 485 nm con un ancho de banda de 10 nm filtra la luz blanca en el rango comprendido entre 480 y 490 nm.

Monocromadores

A diferencia de los filtros ópticos, los monocromadores son capaces de seleccionar luz de distintas longitudes de onda en función de las necesidades. En los lectores de microplacas se utilizan dos tipos de monocromadores: los monocromadores convencionales basados en rejilla o los monocromadores de filtro variable lineal. En los monocromadores basados en rejilla, las longitudes de onda se seleccionan por difracción de la luz blanca en sus colores. A continuación, las longitudes de onda se seleccionan mediante una rendija, que bloquea físicamente la luz no deseada y sólo transmite la deseada. La desventaja del método de rejilla es la baja transmisión de luz y la aparición de luz parásita, que podría llegar al detector y reducir la sensibilidad global de la fluorescencia.

Elmonocromador de filtro variable lineal (LVF) superael problema de la luz parásita, ya que no descompone la luz, sino que literalmente la filtra. El monocromador LVF utiliza dos portaobjetos con un revestimiento de gradiente. Se puede seleccionar cualquier longitud de onda con cualquier ancho de banda deslizando los dos filtros lineales uno contra otro. El monocromador LVF tiene una transmisión similar a la de un filtro, elimina la luz parásita y, por tanto, tiene un mejor rendimiento que los monocromadores de difracción (fig. 6). El uso de filtros lineales variables en lectores de microplacas es una tecnología patentada por BMG LABTECH.

b) Ancho de banda

El paso de banda de los filtros varía desde unos pocos nanómetros hasta 100 nm. El paso de banda afecta a la cantidad de luz que puede pasar el filtro. Los filtros de ancho de banda bajo (~10 nm) se recomiendan para fluoróforos brillantes o para muestras complejas con alta autofluorescencia. Un ejemplo típico son los fluoróforos verdes como AlexaFluor488, FITC o GFP en un entorno celular.

Los filtros de ancho de banda más amplio se recomiendan para fluoróforos de baja emisión si emiten en un rango en el que la autofluorescencia es baja (emisión <600 nm) o si el tampón no contiene ningún otro compuesto fluorescente. BMG LABTECH selecciona los filtros basándose en los espectros de excitación y emisión del fluoróforo. Además, los pares de filtros se miden y emparejan entre sí para que pueda estar seguro de que está recibiendo los mejores filtros posibles. Los ajustes predeterminados para fluoróforos comunes también están ya almacenados para el monocromador, de modo que este trabajo de selección no se deja al investigador.

c) Las medidas FRET requieren dos canales de emisión

Las consideraciones anteriores también se aplican a las mediciones FRET. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que deben registrarse dos emisiones por separado. El fluoróforo donante excitado emite luz a una longitud de onda específica si no hay ningún aceptor cerca. Si hay un fluoróforo aceptor cerca, el donante transfiere la energía al aceptor, que emite luz a una longitud de onda mayor. Esto significa que se necesitan dos filtros de emisión, uno de los cuales sólo permite la emisión del donante y el otro sólo la emisión del aceptor.

Ganancia

Laganancia de fluorescencia esun factor de amplificación, o más exactamente, el voltaje del detector al que se amplifica la señal luminosa entrante. El cambio de la ganancia desplaza el rango dinámico de detección a lo largo de la curva de concentración del analito/ensayo. Sin embargo, la amplitud del rango dinámico es fija y no cambia.

Las señales débiles necesitan una amplificación grande (ganancia alta), y las señales brillantes necesitan menos amplificación (ganancia pequeña). Una ganancia seleccionada incorrectamente puede hacer que los datos medidos sean inutilizables, ya sea porque exceden el rango de medición o porque las diferencias ya no se resuelven. Encontrará información sobre estos efectos en la Nota práctica: ¿Cómo optimizar el ajuste de ganancia de su lector de microplacas? Normalmente, la ganancia se ajusta para obtener una salida de medición máxima en la muestra con la intensidad más alta esperada. Esto se hace para tener la mayor ventana dinámica posible entre los valores de medición más altos y los más bajos (fig. 8).

Todos los lectores de microplacas de BMG LABTECH determinan la ganancia automáticamente, siempre que se identifique un pocillo específico con una intensidad de señal específica. Sin embargo, en los lectoresCLARIOstarPlus y VANTAstar noes necesario ajustar la ganancia. La tecnología EnhancedDynamic Range (EDR) se diseñó específicamente para ofrecer el mayor rango dinámico posible: 8 décadas de concentración. Esto proporciona a los investigadores una comodidad sin precedentes en las mediciones de microplacas, ya que se pueden medir resultados altamente fiables en un amplio rango dinámico sin intervención manual.

Altura focal

La altura a la que se detecta una señal tiene un impacto significativo en la sensibilidad de la medición. La medición a una altura focal no óptima puede reducir la señal hasta en un 90 %. Por ejemplo, las células fluorescentes adherentes deben medirse cerca del fondo de la placa, mientras que una solución fluorescente homogénea da la señal más alta justo debajo de la superficie del líquido y depende del volumen de llenado del pocillo. Algunos lectores de placas determinan la altura focal óptima en un pocillo seleccionado. El CLARIOstar^® Plusy el VANTAstar^® vanmás allá y determinan la altura focal automáticamente durante la lectura de una placa.

Ensayos de fluorescencia - ¿Para qué se utiliza la intensidad de fluorescencia?

El número de ensayos fluorescentes es tan grande como el número de preguntas biológicas y químicas a las que pueden dar respuesta. Por ello, a continuación se describen las aplicaciones más comunes basadas en la intensidad de fluorescencia.

Ensayos de viabilidad celular y citotoxicidad

Si las células resultan dañadas por un compuesto o si las células cancerosas mueren tras el tratamiento son preguntas habituales a las que responden los ensayos de viabilidad y citotoxicidad fluorescentes y los lectores de microplacas. Enel ensayo alamarBlue™, la resazurina es reducida por las células metabólicamente activas a un fluoróforo e informa sobre la viabilidad celular. Otra forma de evaluar la viabilidad celular es la incorporación de nucleósidos marcados con fluorescencia en el ADN. Éstos se incorporan y, en consecuencia, sólo emiten fluorescencia si tiene lugar la replicación del ADN, un marcador de viabilidad.

Una forma de detectar la muerte celular por intensidad de fluorescencia se basa en tintes fluorescentes de ADN como ^SYBR® Greeno Celltox™ Green. Estos colorantes no son permeables a las células, pero se exponen al ADN en solución en caso de que la membrana celular se rompa durante la muerte celular y entonces empiezan a emitir fluorescencia (fig. 9). Estos ensayos son compatibles con las mediciones en tiempo real y pueden monitorizar la salud celular a lo largo del tiempo. Como estas mediciones se realizan a lo largo de días, la cámara de microplacas debe incubarse a 37 °C y con un 5 % de_CO2 paraque las células se mantengan contentas. El CLARIOstar Plus con Unidad de Control Atmosférico hademostrado proporcionar la atmósfera ideal para experimentos celulares a largo plazo. Se describen más ensayos de salud celular en la entrada de nuestro blog "Ensayos de viabilidad celular: mida la felicidad de sus células".

Ensayos de actividad enzimática

Dado que las enzimas intervienen en múltiples procesos biológicos, es importante estudiar cómo influyen los inhibidores o promotores en las actividades enzimáticas. Los principios de los ensayos enzimáticos son comparables: emplean un sustrato prefluorescente que al ser procesado por la enzima libera un fluoróforo. Los fluoróforos habituales se basan en derivados de la cumarina, como en elensayo basado en la fluorescencia de la enzima epigenética histona deacetilasa 1 (HDAC1), donde pueden utilizarse para investigar la inhibición de las histonas deacetilasas.

Un segundo fluoróforo utilizado en ensayos enzimáticos es la 4-metilumbeliferona. Un ejemplo se encuentra en la nota de aplicación "CLARIOstar determina la actividad de una alfa-glucosidasa ácida (GAA) humana producida por musgo en un ensayo basado en fluorescencia". Ellector de microplacasmultimodo CLARIOstarPlus facilita el análisis fluorescente de la actividad enzimática. La tecnología de rango dinámico mejorado permite la lectura en un rango dinámico de 8 décadas. De este modo, la señal creciente en los ensayos de actividad enzimática se registra fácilmente sin riesgo de elegir una ganancia incorrecta ni de perder tiempo optimizando el instrumento. El instrumento se suministra con un software de análisis gratuito con análisis cinético enzimático integrado que cubre los modelos de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk(mediciones cinéticas enzimáticas realizadas en un lector de microplacas BMG LABTECH).

Cambios conformacionales: plegamiento y desplegamiento de proteínas

La fluorescencia de aminoácidos naturales como el triptófano también puede utilizarse para medir los cambios conformacionales y la actividad enzimática de las proteínas. Algunos ejemplos de aplicaciones se describen en la entrada de nuestro blog Fluorescencia del triptófano: la sonda de la naturaleza. La fluorescencia del triptófano es útil, por ejemplo, para buscar nuevas terapias para dianas farmacológicas como los receptores acoplados a proteínas G, una de las dianas más populares para fármacos aprobados en el mercado actual.

Ensayos de agregación de proteínas

Las proteínas se agregan si están mal plegadas y la agregación está relacionada con enfermedades como el Alzheimer, el Parkinson y la enfermedad de los priones. El análisis de la formación de agregados moleculares ayuda a diagnosticar y comprender estas enfermedades, así como a probar posibles fármacos. Los dos fluoróforos bis-ANS y tioflavina T (ThT) aumentan su intensidad de fluorescencia al interactuar con agregados de proteínas. El bis-ANS interactúa preferentemente con agregados amorfos, como se describe en la nota de aplicación "Uso de un lector de microplacas BMG LABTECH para monitorizar la formación de amiloides".

El ThT se une a las fibrillas y se utiliza principalmente en ensayos cinéticos. Si la muestra contiene moléculas inductoras de agregación, las proteínas recombinantes se agregan y la fluorescencia aumenta (fig. 10).

La nota de aplicación "Real-time quaking-induced conversion assay for prion seeding" explica cómo se utiliza el ensayo para detectar las enfermedades priónicas scrapie en homogenados de cerebro de hámster. Dado que estos ensayos de agregación requieren una agitación prolongada, los lectores de microplacas de BMG LABTECH pueden equiparse con sistemas de transporte muy robustos y duraderos.