Was gilt es bei der Auswahl eines Luminescence Plate Readers zu beachten?
Da die Leistung des Gerätes einen wesentlichen Einfluss auf die Qualität der wissenschaftlichen Daten haben kann, gibt es bei der Auswahl eines neuen Luminescence Plate Readers einige Faktoren zu beachten.
Sensitivität
Luminescence entsteht typischerweise durch eine biochemische oder chemische Reaktion und benötigt kein Anregungslicht. Daher bietet sie im Allgemeinen eine höhere Sensitivität im Vergleich zur Messung von Absorption oder Fluoreszenz. Da keine Anregung stattfindet, die Lichtstreuung oder Autofluoreszenz, ausgehend von der Probe oder der Mikroplatte, verursachen könnte, ergibt sich verglichen mit der Fluoreszenzintensität eine deutliche Reduktion von unspezifischen Hintergrund- oder Rauschsignalen.
Unabhängig davon liefern Luminescence Plate Reader mit einer höheren Sensitivität statistisch hochwertigere Daten mit einer geringeren Variabilität zwischen den Replikaten und einem größeren Delta (Unterschied) zwischen den positiven und negativen Proben. Darüber hinaus ermöglicht die bessere Sensitivität die Reduktion der eingesetzen Proben- und Reagenzien bei gleichbleibend hoher Datenqualität und somit eine Reduktion des Kostenaufwands.
Dynamischer Bereich
Luminescence-Reaktionen basieren in der Regel auf der Zugabe eines Substrats, welches eine enzymatische Reaktion startet. Sobald die Reaktion gestartet und eine entsprechende Substratmenge verstoffwechselt wurde, ist die Reaktion erschöpft. Sofern keine neuen Proben oder Reagenzien zugeführt werden, kann die Reaktion nicht erneut ausgelöst werden. Folglich ist es zwingend erforderlich, das Signal aller zu messenden Proben auf einmal mit einem Luminescence Plate Reader zu erfassen, um eine Wiederholung des Assays und den unnötigen Verbrauch zusätzlicher Reagenzien zu vermeiden.
Bei Proben, deren Konzentration sich über einen weiten Bereich erstrecken kann es schwierig sein, alle Signalintensitäten mit nur einer Einstellung zu erfassen. Sehr helle Proben können zur Sättigung des Luminescence-Detektors im Microplate Reader führen. Proben mit geringer Intensität lassen sich gegebenenfalls nicht mehr von den Blanks unterscheiden.
Ein Luminescence Plate Reader mit einem großen Dynamikbereich ermöglicht es auch Proben von sehr unterschiedlicher Intensität in einem Durchgang zu erfassen. Dadurch lassen sich mehrfache Durchgänge zur Ermittlung des richtigen Verhältnisses von Probenverdünnung und Gain Einstellung umgehen und die damit einhergehende Verschwendung von Zeit und Ressourcen vermeiden. Die Funktion "Enhanced Dynamic Range" des CLARIOstar Plus bietet den größtmöglichen Dynamikbereich auf dem Markt (über acht Konzentrationsdekaden) und ermöglicht die automatische Messung sehr intensiver und sehr schwacher Signale in derselben Messung - ohne vorherige Einstellung.
Auswahl der Wellenlängen
In Luminescence Plate Readern, ist die Auswahl von Wellenlängen nicht zwingend erforderlich. Dies trifft insbesondere bei der Detektion von einfachen Luminescence Assays zu. Je nach Anwendung, ist die Option zur Auswahl mehrerer Emissionswellen sehr vorteilhaft. Dies gilt speziell bei Luminescence Assays mit mehreren Signalen verschiedener Wellenlänge oder bei der Entwicklung neuer Assays. Darüber hinaus hilft sie, diese Assays durch die Reduktion von Hintergrundrauschen zu optimieren. Zur Selektion der Wellenlängen können Filter oder Monochromatoren eingesetzt werden.
Durch die Möglichkeit zur gleichzeitigen Detektion in zwei Emissionskanälen ergeben sich für Luminescence Plate Reader zusätzliche Vorteile bei der Durchführung von BRET- und nanoBRET-Assays. Die gleichzeitige Signalaufnahme halbiert die Messzeit und reduziert zudem die Datenvariabilität. Die gleichzeitige Detektion von zwei Emissionswellenlängen. Simultaneous Dual Emission (SDE)-Erkennung ist beim PHERAstar FSX verfügbar und ist eine Option beim LUMIstar Omega und FLUOstar Omega.
Kompatible Mikroplattenformate
Klassische Luminescence Assays werden in der Life Science Forschung üblicherweise in 96-Well Mikroplatten analysiert. Der Umstieg auf 384- oder 1536-Well Platten ermöglicht eine deutliche Zeitersparnis bei hohem Probenumfang und auch eine Kostenreduktion beim Einsatz teurer Reagenzien. Vorweg sollte aber auf jeden Fall sicher gestellt werden, dass der Luminescence Plate Reader Ihrer Wahl auch in der Lage ist, in dem von Ihnen gewünschten Mikroplattenformat zu lesen. Bei der Verwendung von Mikroplatten mit hoher Well- Dichte, sollte das Risiko zum Crosstalk zwischen den Wells besonders berücksichtigt werden.
Flash- oder Glow- Reaktionen
Bei der Auswahl eines Luminescence Plate Readers spielt der gewünschte Assaytyp eine wesentliche Rolle. Luminescence Reader können anhand ihrer Kinetik in Flash- und Glow-Reaktionen eingeteilt werden. Flash-Luminescence beschreibt eine kurzlebige Reaktion, die ein sehr intensives Signal für eine sehr kurze Zeitspanne (klassisch über wenige Sekunden) freisetzt. Glow-Luminescence resultiert hingegen in einem eher langlebigen Signal über mehrere Minuten. Allerdings ist die Signalintensität bei der Glow-Luminescence gegenüber der Flash-Luminescence deutlich geringer.
Glow-Reaktionen können von jedem Luminescence Plate Reader detektiert werden. Flash-Assays erfordern hingegen den Einsatz von Reagenzinjektoren. Bei der manuellen Zugabe von Reagenzien in die Wells besteht das Risiko, den Zeitpunkt mit der maximalen Signalintensität zu verpassen, da das kurzlebige Signal bereits vor der Detektion abgeflacht sein könnte. Unsere mit Injektoren ausgestatteten Luminescence Plate Reader, erlauben die gleichzeitige Injektion und Signaldetektion bevor die Messung im nächsten Well fortgesetzt wird.
Auch für Dual Luciferase Reporter (DLR) Assays sind Injektoren von Vorteil. Hier wird in einer Probe nacheinander die Aktivität von zwei Luziferasen mit einem Luminescence Plate Reader gemessen. Die Signalintensität gibt dabei Auskunft über die Transkription eines Zielgens und einer Transfektionskontrolle. Beide Auswertungen können mit Luminescence Plate Readern und Reagenzinjektoren innerhalb von etwa 4 Sekunden durchgeführt werden.
Crosstalk
Wenn bei einer Messung neben dem eigentlichen Ziel-Well zusätzlich Licht von benachbarten Wells aufgenommen wird, spricht man von einer unspezfischen Signalübertragung (Crosstalk). Dadurch kann es zu einer Verfälschung der tatsächlichen Ergebnisse kommen. Unspezifische Lichtsignale von benachbarten Wells können den Detektor entweder ausgehend von der Oberseite der Wells oder durch die Kunstoffwand der Mikroplatten erreichen.
High-End Luminescence Plate Reader, wie der CLARIOstar Plus und der PHERAstar FSX können diesen Fehler kompensieren, indem sie das von den benachbarten Wells stammende Licht physisch blockieren. Darüber hinaus berechnen spezielle Algorithmen die Menge des durch die Kunststoffwand transmittierten Lichts und ziehen es von den eigentlichen Proben ab.
Unsere Luminescence Plate Reader
Luminescence lässt sich auf BMG LABTECHs zweckgebundenem Luminescence Plate Reader, dem LUMIstar® Omega, sowie auf Multi-Mode Microplate Readern wie dem PHERAstar® FSX, CLARIOstar® Plus, FLUOstar® und POLARstar® Omega detektieren.
Alle unserer Luminescence Plate Reader sind für die Durchführung von Dual-Luciferase-Reporter-Assays zertifiziert, verwenden ein rauscharmes PMT (Photomultiplier Tube) und können mit hochpräzisen Reagenzinjektoren ausgestattet werden.
Welche Assays lassen sich mit einem Luminsescence Plate Reader detektieren?
