Lector de placas de fluorescencia

Un lector de placas de fluorescencia (también llamado lector de microplacas de fluorescencia, lector de fluorescencia, fluorímetro y espectrofluorímetro) es un equipo capaz de detectar y cuantificar los fotones de luz emitidos por una muestra fluorescente presente en una microplaca tras su excitación con luz de una longitud de onda específica.

Los lectores de placas de fluorescencia suelen estar destinados a la detección de la intensidad de fluorescencia y del FRET. Otros modos de detección basados en la fluorescencia, como la polarización de la fluorescencia o la fluorescencia de resolución temporal y TR-FRET, solo pueden detectarse con lectores de microplacas multimodo y no con lectores de microplacas de fluorescencia de modo único. Para cubrir adicionalmente estos modos de detección, así como la absorbancia y la luminiscencia, normalmente se requieren lectores de microplacas multimodo.

Los lectores de microplacas de fluorescencia suelen contener una fuente de luz, un sistema óptico para la selección de la luz entrante (es decir, filtros y/o monocromadores), un segundo sistema óptico para la selección de la luz de emisión y un detector, normalmente uno o varios tubos fotomultiplicadores (PMT). Estos convierten los fotones generados por los colorantes fluorescentes o luminiscentes en electricidad, que luego es cuantificada por el lector de microplacas. El resultado de este proceso son números mediante los cuales se cuantifica una muestra.

A diferencia de la absorbancia, la detección de fluorescencia no es una medida absoluta. La intensidad de la señal fluorescente suele ser relativa a otras medidas o a una medida de referencia tomada por un instrumento. En consecuencia, los lectores de placas de fluorescencia miden la señal de luz emitida por una muestra en Unidades de Fluorescencia Relativas (RFU, por sus siglas en inglés).

Los lectores de placas de fluorescencia están disponibles como lectores independientes y específicos (fluorímetros) o como parte de lectores de microplacas multimodo, cuando se combinan con detección de absorbancia y/o luminiscencia.

Los lectores de placas de fluorescencia se utilizan para diferentes ensayos y aplicaciones en varios campos, como la investigación académica en ciencias de la vida, el descubrimiento y la detección de fármacos, los laboratorios clínicos, la biología sintética y el control de la calidad del agua o de los alimentos.

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Si está buscando un nuevo lector de placas de fluorescencia (de modo único o multimodo), hay algunos factores que debe tener en cuenta, ya que el rendimiento del instrumento puede afectar significativamente la calidad de los resultados de su investigación.

Sensibilidad

Para fines de cuantificación, los lectores de placas de fluorescencia generalmente ofrecen una mayor sensibilidad que los lectores de absorbancia. Sin embargo, un lector de microplacas de fluorescencia con alta sensibilidad proporcionará datos con una mejor estadística, menor variabilidad entre réplicas y un mayor delta (distancia) entre las muestras que responden y las que no. Además, una mayor sensibilidad le permitirá reducir la cantidad de reactivos y/o muestras utilizados para lograr resultados de buena calidad y, en consecuencia, reducir sus costes.

Rango dinámico

En la detección por fluorescencia, las muestras suelen cubrir una amplio rango de concentraciones. Las señales que deben medirse en un lector de placas de fluorescencia pueden abarcar una amplia gama de intensidades de señal, desde tenues hasta muy brillantes. Además, las muestras de ensayos cinéticos enzimáticos o basados en células suelen ser difíciles de predecir en cuanto a la intensidad de la señal, ya que su señal máxima se acumula durante un lapso de tiempo durante el transcurso del ensayo cinético.

En estos casos, puede ser difícil adquirir todas las señales en una medición con un único ajuste. Las muestras muy brillantes pueden saturar el detector de fluorescencia del lector de microplacas. Las muestras muy tenues pueden no ser discernibles de los espacios en blanco.

Tener un amplio rango dinámico permite que su lector de placas de fluorescencia adquiera muestras altamente divergentes en una sola ejecución, evitando el desperdicio de reactivos y tiempo causado por múltiples mediciones de prueba y error para encontrar la relación correcta entre la dilución y la ganancia de fluorescencia. La función de rango dinámico ampliado en PHERAstar FSX, CLARIOstar Plus y VANTAstar ofrece el rango dinámico más amplio posible del mercado (8 décadas de concentración) y permite medir automáticamente ensayos con señales muy brillantes y tenues en la misma medición, sin necesidad de ajustes.

Selección de longitud de onda

La capacidad de seleccionar la longitud de onda en los lectores de microplacas de fluorescencia es obligatoria tanto para la excitación como para la emisión. Esto ayuda a reducir el ruido de fondo o el ruido inespecífico que normalmente se produce por la dispersión de la luz o la autofluorescencia tanto de la muestra como de la microplaca.

Se pueden emplear filtros o monocromadores para este fin. Los filtros suelen ser más sensibles, mientras que los monocromadores ofrecen más flexibilidad. Una excepción a este paradigma es el sistema monocromador de filtro variable lineal (LVF) disponible en CLARIOstar Plus y VANTAstar. Los monocromadores LVF tienen un rendimiento similar al de un filtro y hacen que CLARIOstar Plus sea el lector de microplacas basado en monocromadores más sensible del mercado. Los monocromadores LVF se pueden utilizar en intensidad de fluorescencia y luminiscencia. Además, los monocromadores tienen la capacidad de adquirir escaneos de excitación o emisión.

Además, la capacidad de detectar dos canales de emisión simultáneamente en un lector de placas de fluorescencia es muy beneficiosa para los ensayos FRET. Esta opción reduce a la mitad el tiempo de medición y reduce la variabilidad de los datos. La detección de emisión dual simultánea (SDE) está disponible en PHERAstar FSX y es una opción en LUMIstar Omega y FLUOstar Omega.

Formatos de microplacas compatibles

Normalmente, en la investigación de las ciencias de la vida, los ensayos básicos de fluorescencia se miden en microplacas de 96 pocillos. Sin embargo, si tiene varias muestras y/o desea ahorrar valiosos reactivos o tiempo, también se pueden utilizar los formatos de 384 pocillos y 1536 pocillos. Solo asegúrese de que el lector de microplacas de fluorescencia de su elección también sea capaz de leer el formato de microplacas que planea usar. Además, la detección de absorbancia, fluorescencia y luminiscencia requiere diferentes tipos de placas.

Inyectores de reactivos

Cuando busque un lector de placas de fluorescencia, debe considerar la naturaleza del ensayo que desea ejecutar. Para ensayos cinéticos enzimáticos o respuestas celulares en tiempo real, el uso de inyectores de reactivos puede ser beneficioso. Al pipetear manualmente los reactivos en los pocillos, puede correr el riesgo de perder datos importantes de su reacción. Especialmente para respuestas rápidas, es posible que el evento que está buscando ya haya desaparecido antes de que lo detecte. Nuestros lectores de placas de fluorescencia equipados con inyectores de reactivos pueden inyectar y detectar simultáneamente la señal de un pocillo y luego pasar al siguiente.

Control ambiental
Si su investigación requiere ensayos basados en células vivas de larga duración (por ejemplo, estudios de viabilidad celular)  y no desea estar trasladando su microplaca de un lado a otro entre el lector y la incubadora, asegúrese de que el lector elegido tenga la capacidad de controlar su entorno de gas interno.

La serie Omega, el VANTAstar y el CLARIOstar Plus pueden equiparse con nuestra Unidad de Control Atmosférico (ACU). La ACU proporciona el entorno ideal para cualquier aplicación con células vivas. La ACU regula de forma independiente los niveles de gas O₂ y CO₂ dentro de la cámara del lector de microplacas. En combinación con la agitación y la incubación de temperatura, la ACU proporciona una verdadera solución para cualquier ensayo basado en células, desde el crecimiento celular estándar hasta los ensayos hipóxicos.

Software para reducción de datos
Generalmente, el software que ejecuta el lector de microplacas es una parte muy subestimada del paquete. Para algunos lectores, el software solo controla el proceso de medición y proporciona una salida de datos de ensayo sin procesar. En otros casos, puede realizar análisis complejos.

Un software integral, fácil de usar y flexible puede facilitarle la vida, simplificar la detección y el análisis de datos para que pueda aprovechar al máximo su instrumento.

Las funciones de cálculo más útiles para los ensayos de fluorescencia incluyen la sustracción automática en blanco, el cálculo automático de concentraciones basado en curvas estándar y constantes enzimáticas como K_m y V_max.

En el paquete de software BMG LABTECH, los ensayos más comunes tienen protocolos específicos de ensayos de ejecución rápida predefinidos y plantillas de análisis dedicadas. A través de estas soluciones dedicadas, la adquisición y el análisis de sus resultados se realizan con un solo clic del ratón, lo que permite a los investigadores realizar experimentos de forma rápida y sencilla.