PHERAstar FSX
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흡광도란 무엇인가요?
일반적으로 흡광도는 빛이 물질과 상호작용하는 과정입니다. 빛이 빛의 일부를 흡수하는 물체에 부딪히면 우리는 흡광도라고 말합니다. 물론 흡수된 빛은 손실되지 않고 흡수된 분자가 여기되면서 열이나 화학 에너지로 변환됩니다. 흡광도는 우리가 색을 볼 때 매일 접하는 물리적 과정입니다: 햇빛과 같은 백색광은 가시광선의 모든 색을 포함하고 있습니다. 이 빛이 녹색 잔디에 비추면 잔디는 녹색을 제외한 모든 색을 흡수합니다. 녹색 빛은 다시 방출되고 이것이 잔디에 색을 부여합니다.
흡광도 측정의 이론적 배경
큐벳 및 마이크로플레이트에서의 검출 경로
전통적으로 흡광도 측정은 큐벳에서 수행되었습니다: 흡광도 특성이 알려진 분석물질이 포함된 용액을 큐벳에 넣습니다. 그런 다음 흡광도 판독기가 시료를 통해 알려진 강도의 빛을 보내고 시료 뒤의 강도를 감지하여 흡광도를 결정합니다. 검출기에 통과하지 못한 빛은 흡수되거나 산란된 것입니다. 산란된 부분은 적절한 블랭크를 측정하여 별도로 결정하고 이 값에서 차감하여 관심 물질의 순 흡광도를 얻습니다.
흡광도 측정 결과 - 투과율, 흡광도 및 광학 밀도
시료를 통과할 수 있는 빛의 부분을 투과율이라고도 하며 주로 백분율로 표시됩니다(그림 2). 용액에 분석 물질이 많을수록 더 많은 빛이 흡수되고 투과율은 낮아집니다. 그러나 흡광도는 분석 물질이 흡수한 빛의 일부입니다. 투과율1의 로그(10의 거듭제곱)의 절대값입니다. 다음은 투과율과 흡광도로 설명할 수 있는 수학 방정식과 몇 가지 수치입니다:
투과: T =Iout /Iin
흡광도: A =-log10T
표 1: 투과율 및 흡광도 값에 따른 예시
| 투과 | 흡광도 |
| 0.1(또는 10%) | 1 OD |
| 0.01(또는 1%) | 2 OD |
| 0.001(또는 0.1%) | 3 OD |
화학 및 생명 과학에서의 흡광도 - 용액 내 물질의 정량화
흡광도 측정을 수행한 후 결과는 투과도 또는 광학 밀도로 주어진 값입니다. 그러나 측정의 목표는 용액 속의 물질을 정량화하는 것이므로 신호를 농도 값으로 변환하는 방법이 중요합니다. 일반적으로 두 가지 방법이 있습니다: 맥주-램버트 법칙을 사용하거나 농도를 알 수 없는 시료와 표준 곡선을 병행하여 측정하는 것입니다.
비어-램버트 법칙
비어-램버트 법칙은 흡수 물질의 흡광도, 경로 길이 및 농도의 관계를 설명합니다:
A=c*d*ε
c로 변경: c=A/(d*ε)
비어-램버트 법칙은 A - 흡광도, c - 농도, d - 경로 길이, ε - 소멸 계수입니다.
이 법칙에 따르면 흡광도는 농도에 경로 길이와 소멸 계수2를 곱한 값에 선형입니다. 경로 길이는 빛이 통과해야 하는 시료의 길이를 나타냅니다. 예를 들어 큐벳에서 경로는 1cm로 표준화됩니다. 소멸 계수는 흡수 물질과 특정 파장에 특정한 상수이며, 일반적으로 물질의 최대 흡광도입니다. 특정 물질이 특정 파장에서 빛을 얼마나 강하게 흡수하는지에 대한 정보를 제공합니다. 예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA)의 질량 소멸 계수는 0.67µl*cm-1*µg-1입니다. 따라서 경로 길이가 1cm인 1µg/µl BSA 용액은 0.67 OD의 흡광도를 갖습니다.
비어-램버트 법칙은 다른 시약을 추가할 필요 없이 흡수 물질을 정량화할 수 있어 매우 유용합니다. 그러나 아래에 설명된 대로 제한이 있습니다.
비어-램버트 법칙은 다음과 같은 경우에만 사용할 수 있습니다.
- 분석물질이 특정 파장에서 빛을 흡수합니다.
- 경로 길이가 알려진 경우
- 분석물질의 소멸 계수가 알려진 경우
- 완충 시약의 흡광도가 분석물질의 흡광도와 겹치지 않는 경우
표준 곡선 사용
이러한 기준 중 하나라도 해당되지 않는 경우 분석물을 간접적으로 측정하거나 표준 곡선을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 브래드포드 분석과 같은 비색 단백질 정량 분석은 단백질이 있을 때 흡광도를 증가시키는 물질에 의존합니다. 이 증가는 시료뿐만 아니라 알려진 단백질 농도가 있는 표준 곡선에서 측정되어 농도를 계산할 수 있습니다.
흡광도는 어떻게 감지하나요?
광원
빛의 투과/흡수를 측정하려면 먼저 빛이 필요합니다. 흡광도 측정에는 다양한 광원을 사용할 수 있습니다. 광원이 커버하는 스펙트럼 범위, 강도 및 방출하는 빛의 안정성이 다릅니다.
텅스텐 할로겐 램프는 360nm에서 1000nm 이상의 범위를 커버하며 비용 효율이 높아 자주 사용됩니다. 그러나 제논 플래시 램프는 220nm에서 1000nm까지의 스펙트럼 영역을 커버하며 스펙트럼의 자외선 범위를 커버합니다. 따라서 핵산(260nm)과 단백질(280nm)의 검출 및 정량화가 가능합니다. 비엠지랩텍 흡광도 마이크로플레이트 판독기에는 흡광도 측정을 위한 제논 플래시 램프가 장착되어 있어 220~1000nm 사이의 모든 파장 또는 전체 파장 스펙트럼을 측정할 수 있는 최고의 유연성을 제공합니다.
샘플
흡광도를 측정하려면 관심 있는 액체를 큐벳이나 마이크로플레이트에 옮겨야 합니다. 연구자가 관심을 갖는 것은 물질이 아닌 용액의 흡광도이기 때문에 큐벳과 마이크로플레이트의 재질은 항상 투명해야 빛이 최대한 투과할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 다양한 재료가 일반적이며 서로 다릅니다. 폴리스티렌이 가장 많이 사용되며 세포 배양이나 ELISA 용도에 따라 특정 결합 특성을 제공하도록 변경될 수 있습니다. 그러나 자외선 범위에서 비투과성이므로 400nm 미만의 흡광도를 측정하려면 고리형 올레핀 공중합체의 특수 판을 사용해야 합니다.
샘플 부피
고려해야 할 두 번째 측면은 신뢰할 수 있는 흡광도 측정에 필요한 시료의 양입니다. 표준 큐벳은 약 4.5ml가 필요하지만 세미마이크로 볼륨 큐벳은 1.5ml까지, 마이크로 볼륨 큐벳은 70µl까지 부피를 줄일 수 있습니다. 큐벳 측정은 수평으로 이루어집니다. 한쪽에서 시료로 빛을 보내면 반대쪽에서 투과된 빛이 감지됩니다. 따라서 큐벳의 기하학적 구조는 1cm의 표준화된 경로 길이를 제공합니다. 이는 수직으로(위에서 아래로 또는 아래에서 위로) 진행되는 마이크로 플레이트 측정과의 주요 차이점 중 하나입니다. 따라서 경로 길이도 시료 부피에 따라 달라지며 한 번의 실험에 동일한 부피를 사용해야 합니다. 또한 메니스커스 효과는 마이크로플레이트 흡광도 측정에서 경로 길이에 중요한 역할을 하는데, 이는 방법 참고: 마이크로플레이트에서 경로 길이 및 메니스커스를 다루는 방법에 자세히 설명되어 있습니다. 마이크로 플레이트 중앙에서 수행한 측정은 메니스커스가 없는 측정에 비해 강한 메니스커스가 있는 경우 경로가 훨씬 짧아집니다. 이는 맥주-램버트를 적용하거나 실험에서 반월판이 매우 가변적인 경우에 특히 중요합니다. 수용액에서는 물의 흡광도를 활용하여 반월상 연골에 따른 경로 길이 변화를 보정할 수 있습니다(물-피크 경로 길이 보정).
표준 96 웰 플레이트는 일반적으로 100~300µl 범위의 샘플 부피에 사용되며, 2.9~7.4mm인 경우 대략적인 경로 길이로 변환됩니다. 경로 길이를 그대로 유지하면서 귀중한 시료의 부피를 더 줄여야 할 수도 있습니다. 이를 위해 반면적 플레이트 또는 고밀도 플레이트를 사용할 수 있습니다. 이 플레이트는 웰 면적은 더 작지만 표준 96웰 플레이트와 높이는 동일하므로 더 적은 부피로 높은 경로 길이를 제공할 수 있습니다.
적절한 블랭크
버퍼 성분, 플레이트 및 빛 산란 효과로 인한 원하지 않는 흡광도에 대한 흡광도 측정을 보정하기 위해 블랭크는 시료와 병행하여 측정합니다. 적절한 블랭크에는 분석물을 제외한 분석의 모든 성분이 포함되어 있습니다. 반대로, 이는 PBS 또는 물 블랭크가 불충분한 경우가 많다는 것을 의미합니다.
분석 시료와 블랭크에서 발견되는 입자에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 입자는 빛을 산란시키고 검출기에 도달하는 빛의 양이 적어지기 때문에 측정된 흡광도 값이 증가합니다. 입자가 용액에서 움직일 때 빛의 경로를 차단하면 감지됩니다. 감지 경로를 벗어나면 측정되지 않습니다. 이 현상은 흡광도 데이터의 변동성을 증가시킵니다. 측정된 용액에서 입자를 제거할 수 없는 경우 흡광도 측정 시 마이크로 플레이트의 면적을 넓게 커버하는 것이 좋으며, 이는 모든 BMG LABTECH 기기가 흡광도 측정을 위해 제공하는 기능입니다.
흡광도 측정 검출기
투과된 빛이 시료를 통과한 후에는 이를 감지해야 합니다. 마이크로플레이트 판독기에는 일반적으로 두 가지 유형의 검출기, 즉 광증배관(PMT) 또는 CCD 분광기가 사용됩니다. PMT 기반 시스템은 검출 전에 파장을 선택해야 합니다. 이는 시료로 유도되기 전에 원하는 파장을 선택하는 광학 필터 또는 모노크로메이터에 의해 수행됩니다. 그러면 원하는 파장의 투과광이 PMT에 도달합니다. PMT는 투과된 빛의 신호를 증폭하여 그 강도를 나타내는 전압을 생성합니다. 다양한 파장 범위에서 흡광도를 스캔하기 위해 PMT 기반 시스템은 스펙트럼의 각 지점에 대해 원하는 파장을 선택하고 순차적으로 측정하는 모노크로메이터를 사용합니다.
이것이 두 번째 유형의 흡광도 감지기인 분광계와의 주요 차이점입니다. 분광기는 투과된 빛을 여러 파장으로 분할하고 이를 CCD 검출기로 보내 모든 파장의 강도를 한 번에 캡처합니다. 이렇게 하면 스펙트럼뿐만 아니라 단일 또는 소수의 파장 측정도 비슷한 시간 내에 획득할 수 있습니다. 예를 들어, BMG LABTECH 기기는 흡광도 측정에 UV/vis 분광기를 사용하여 1초 이내에 전체 스펙트럼(220~1000nm)을 캡처합니다.
