Nefelometría

¿Qué es la nefelometría?

La nefelometría (del griego nephelo: nube) es una técnica de química analítica utilizada para medir la cantidad de turbidez o enturbiamiento de una solución causada por la presencia de partículas insolubles en suspensión.

Cuando se dirige a través de una solución turbia que contiene partículas sólidas en suspensión, la luz se transmite, se absorbe (bloquea) y se dispersa (se refleja en las partículas; fig. 1). La cantidad de luz dispersa depende del tamaño, la forma y la concentración de las partículas insolubles en la solución, así como de la longitud de onda de la luz incidente.

Las teorías y conceptos sobre la dispersión de la luz fueron elaborados inicialmente a finales del siglo XIX y principios del XX, principalmente por Rayleigh, Mie y Debye.

La nefelometría se aplicó por primera vez en el campo de la química clínica a los inmunoensayos para la detección y cuantificación de proteínas séricas en la sangre, como las inmunoglobulinas y las macromoléculas. Estas aplicaciones siguen utilizándose hoy en día. Aplicadas a los lectores de microplacas, se utilizan principalmente para analizar la precipitación de materiales (fig. 2), como la solubilidad de fármacos y la agregación de proteínas, o el crecimiento bacteriano.

Diferencia entre nefelometría y turbidimetría

La turbidez o enturbiamiento puede detectarse mediante nefelometría o turbidimetría. Ambas técnicas no son destructivas y se basan en la dispersión de la luz provocada por una suspensión de partículas sólidas. Aunque estos dos términos se utilizan a veces como sinónimos, técnicamente no lo son. La turbidimetría es el proceso de medición de la pérdida de intensidad de la luz transmitida a través de una muestra causada por el efecto de dispersión de las partículas insolubles. Al igual que la absorbancia, la turbidimetría cuantifica la intensidad de la luz transmitida a través de la muestra, en particular su atenuación. En la turbidimetría, la luz de una longitud de onda conocida se hace pasar a través de una muestra que contiene partículas insolubles en solución. Un detector situado en línea con la fuente de luz recoge la luz que atraviesa la muestra (fig. 3A). La disminución de la transmisión de la luz se mide en comparación con una referencia, y la luz absorbida se cuantifica como unidades de densidad óptica (DO).² Por consiguiente, la turbidez puede medirse, por ejemplo, utilizando un lector de microplacas de absorbancia.

En cambio, la nefelometría determina la turbidez de una solución cuantificando directamente la intensidad de la luz dispersada por las partículas insolubles de la muestra. Normalmente, la luz dispersa se mide en un ángulo relativo a la fuente de luz incidente, para evitar la interferencia de la posible luz transmitida (fig. 3B). En este sentido, comparte similitudes con la medición de la intensidad de fluorescencia.

Nefelometría frente a turbidimetría

Cuando se realizan ensayos de dispersión de la luz, la elección entre nefelometría o turbidimetría viene dictada principalmente por dos factores.

• La concentración de la muestra yla intensidad resultante de la luz dispersa en relación con la intensidad de la fuente luminosa es el factor más relevante. Si la muestra contiene un pequeño número de partículas insolubles (concentraciones bajas), la intensidad de la luz transmitida será aproximadamente comparable a la intensidad de la fuente luminosa. En este caso, la nefelometría es una opción más adecuada. Como en la absorción molecular apenas puede determinarse una pequeña diferencia entre dos señales intensas, la turbidimetría es más adecuada cuando las muestras contienen una alta concentración de partículas insolubles y, por tanto, la transmisión de luz disminuye considerablemente.

• El tamaño de las partículas dispersas esel segundo parámetro a considerar, ya que afecta a la cantidad de luz que se refleja (bloquea) o se dispersa. La reflexión tiene lugar cuando el tamaño de las partículas es mayor que la longitud de onda de la luz incidente. Si el tamaño de la partícula es comparable o inferior a la longitud de onda incidente, se producirá dispersión. Por consiguiente, la nefelometría es más adecuada para detectar partículas pequeñas, siendo 0,1 - 1 μm el tamaño óptimo, ya que la dispersión predomina sobre la reflexión. El tamaño de las partículas es menos relevante para la turbidimetría, ya que se detecta la disminución relativa de la transmisión de la luz. De hecho, la detección turbidimétrica sigue siendo factible incluso cuando el gran tamaño de las partículas provoca un aumento de la reflexión o la refracción.

En consecuencia, la nefelometría es más adecuada y ofrece una mayor sensibilidad para el análisis de partículas pequeñas en suspensión a bajas concentraciones. La turbidimetría suele aplicarse a partículas insolubles relativamente grandes a altas concentraciones. Por ejemplo, se utiliza habitualmente en biología para determinar el número de células (por ejemplo, bacterias) en una solución.³

Principio de la nefelometría

La dispersión de la luz enlos líquidos sigue las reglas de la dispersión elástica de la física de partículas, en la que ninguna partícula absorbe energía durante la "colisión". La energía de un fotón antes y después de la dispersión no cambia. La dispersión elástica es diferente en partículas grandes y pequeñas. En el caso de las partículas grandes, la luz se dispersa principalmente en la dirección frontal (en ángulo recto). Cuando el tamaño de las partículas es inferior al 5% de la longitud de onda de la luz que las golpea, la dispersión se distribuye simétricamente.⁴

Las moléculas solubles suelen tener un tamaño pequeño (en comparación con las longitudes de onda de la luz incidente) y se dispersan de forma casi simétrica (fig. 4A). Por el contrario, los precipitados y complejos en solución suelen tener un tamaño mayor (más cercano a las longitudes de onda de la luz incidente), produciendo predominantemente una dispersión en ángulo hacia delante (fig. 4B). La detección nefelométrica se centra normalmente en la medición de la dispersión hacia delante.

La dispersión y la concentración de partículas

La intensidad de la luz dispersa (I_S) y la concentración del precipitado (C) se relacionan mediante la siguiente ecuación:

I_S=k_S*I₀* C

donde k_S esuna constante determinada a partir de una calibración del sistema e I₀ esla intensidad en la fuente luminosa.

Las propiedades físicas de una suspensión de partículas están influidas por distintas variables. Aunque la dispersión está relacionada con la concentración de partículas sólidas en la solución, la intensidad de la luz dispersada también depende de su tamaño y forma. Muestras igualmente concentradas que contengan precipitados de distintos tamaños mostrarán diferentes niveles de dispersión.

Además, el tamaño y la forma del precipitado se ven afectados por la temperatura, el pH y la concentración del reactivo, así como por el orden de mezcla, la agitación y el intervalo entre la formación del precipitado y la detección. Para obtener condiciones y resultados reproducibles entre muestras y ensayos, es necesario tener en cuenta todas estas variables diferentes.^{4, 5}

Longitud de onda de la fuente de luz

La selección de la longitud de onda suele ser irrelevante, ya que generalmente no se tiene en cuenta la absorción de la luz incidente por las partículas en suspensión, siempre que no induzca la fluorescencia de la muestra. Así, si se utilizan muestras no fluorescentes, no hay necesidad específica de seleccionar la longitud de onda. La elección de la longitud de onda se basa principalmente en la necesidad de minimizar las posibles interferencias y afecta más bien a la intensidad de la luz incidente o de la propia dispersión.⁴

Instrumentación de la nefelometría: ¿cómo se detecta?

Aunque los fluorómetros pueden emplearse para la detección nefelométrica, la dependencia angular de la dispersión fomentó el desarrollo de dispositivos específicos. Los turbidímetros con detectores situados en ángulo respecto al haz incidente se denominan nefelómetros y se consideran el instrumento estándar para la medición de valores bajos de turbidez. Miden la intensidad de la luz dispersa. La luz transmitida no se detecta.

Los componentes básicos de este dispositivo incluyen una fuente de luz, una óptica de dispersión de la luz y un detector. La fuente de luz genera un haz que se dirige a través de la muestra. Como fuentes de luz pueden utilizarse lámparas halógenas y de xenón o láseres. Los láseres suelen ser la opción más común, debido a su sensibilidad, alta intensidad y naturaleza coherente (los fotones emitidos están "acompasados" entre sí). Las longitudes de onda entrantes y salientes son idénticas y, por tanto, no se seleccionan ópticamente.

Se coloca un detector frente a la fuente de luz y en un ángulo relativo al haz de luz entrante. Según su posición, detecta las variaciones de la dispersión frontal o lateral. Dependiendo del ángulo en el que se pueda recoger la mayor parte de la dispersión, los detectores pueden colocarse en ángulos de 30°, 70° o 90°.

La nefelometría puede realizarse como medición de punto final o cinética. Las mediciones de punto final cuantifican la máxima dispersión de luz después de que una reacción alcanza el equilibrio o en un punto de tiempo predeterminado. La detección cinética (múltiples lecturas a lo largo del tiempo) puede aplicarse durante todo el proceso de precipitación y suele proporcionar más información sobre la reacción.

Aplicación de la nefelometría

Desde la década de 1970, la inmunonefelometría se aplica en los laboratorios clínicos para el análisis de inmunoensayos. Originalmente se utilizaba para detectar la formación y precipitación de complejos inmunes (antígeno-anticuerpo), una aplicación que se sigue utilizando hoy en día. La inmunonefelometría también se utiliza para determinar la concentración de proteínas séricas, incluida la inmunoglobulina, así como en coagulómetros automatizados de gran volumen. Estos dispositivos cuantifican los factores de coagulación en muestras de sangre y permiten realizar perfiles de coagulación de ensayos múltiples.

En los laboratorios farmacéuticos, la nefelometría se utiliza principalmente para evaluar la solubilidad de fármacos o compuestos. Además, es un método prometedor para la cuantificación del crecimiento microbiano y se utiliza habitualmente para determinar el recuento celular de suspensiones de microorganismos como la levadura (por ejemplo, S. cerevisiae).⁶

Nefelometría basada en microplacas

La nefelometría también puede detectarse en microplacas (fig. 5). Este formato es especialmente ventajoso para los laboratorios de ciencias de la vida y la industria farmacéutica, ya que la manipulación de muestras y compuestos en microplacas aumenta tanto la eficiencia como el rendimiento. Los nefelómetros basados en microplacas suelen proporcionar un mayor rendimiento, un enfoque simplificado y de bajo volumen para la recogida de datos de turbidez.El primer dispositivo de detección nefelométrica en microplacas basado en láser del mundo, el NEPHELOstar Plus, fue desarrollado por BMG LABTECH. Este instrumento detecta partículas en solución en un pocillo de microplaca midiendo la luz dispersa angulada hacia delante generada cuando se dirige un haz láser a través de la muestra.

Como fuente de luz, un diodo láser altamente colimado ofrece intensidad y diámetro del haz ajustables. Estas características reducen los problemas de menisco y optimizan la sensibilidad, lo que permite realizar mediciones en formatos de placa de 384 pocillos.

En el NEPHELOstarPlus, el haz láser pasa a través del pocillo de muestra a una esfera de Ulbricht (esfera integradora) situada debajo de la microplaca. Esta esfera recoge la luz dispersa que incide en cualquier punto de su superficie interior y la distribuye por igual a todos los demás puntos mediante reflexiones múltiples. La esfera de Ulbricht recoge la luz dispersa de hasta un ángulo de 80°, conserva su intensidad pero minimiza los ángulos de dispersión originales, eliminando así la información espacial y produciendo una luz difusa que puede ser cuantificada por el detector (fig. 6).

Si el haz de luz no es desviado por el precipitado en el pocillo, pasa directamente a través de la esfera de Ulbricht, no se produce ninguna reflexión y, en consecuencia, no llega ninguna señal al detector. Si hay partículas en la muestra, la luz se dispersa, se refleja en el interior de la esfera de Ulbricht y, en última instancia, es medida por un detector situado en un ángulo de 90° con respecto a la luz incidente (fig. 7).

La turbidez se expresa a menudo en NTU (unidades nefelométricas de turbidez), especialmente en las pruebas de calidad del agua. Los valores de NTU pueden obtenerse a partir de un instrumento calibrado basado en mediciones comparativas con suspensiones de formazina de referencia. Sin embargo, se trata de un proceso que requiere mucho tiempo, varios pasos y grandes volúmenes de muestra. El NEPHELOstar Plus cuantifica los resultados en unidades nefelométricas relativas (RNU). En la nota de aplicación "Mejora del rendimiento para evaluar las unidades nefelométricas de turbidez (NTU) utilizando el NEPHELOstar Plus" se describe cómo comparar las NTU con las RNU. La correlación entre los dos enfoques se representa en la figura 8.

Calidad de las microplacas

Normalmente, los ensayos nefelométricos se realizan en microplacas de 96 o 384 pocillos. La calidad óptica de una microplaca es un aspecto extremadamente importante. Imperfecciones como polvo, suciedad, huellas dactilares o arañazos en el fondo de los pocillos pueden dispersar la luz, generando señales falsas positivas, reduciendo la ventana del ensayo o dando lugar a una sensibilidad significativamente reducida. Por lo tanto, los pocillos con valores especialmente altos o con valores superiores a la media del blanco más dos desviaciones estándar no deben tenerse en cuenta normalmente.⁷

Aplicaciones de la nefelometría basada en microplacas

La nefelometría basada en microplacas es una herramienta inestimable para la industria farmacéutica debido a su aplicabilidad en los cribados de solubilidad de compuestos de alto rendimiento. Además, puede utilizarse para el crecimiento microbiano y la cinética de unión a proteínas, para medir la propensión a la calcificación en fluidos corporales, los factores reumatoides en suero, la unión antígeno-anticuerpo (fig. 9), y mucho más.

Ensayos de solubilidad de fármacos

En la industria farmacéutica,el cribado de alto rendimiento es un método importante para el descubrimiento de fármacos. La evaluación de la solubilidad en este proceso es obligatoria para determinar la validez de los resultados farmacológicos y la selección de compuestos prometedores. La solubilidad de los fármacos tiene un gran impacto en su disponibilidad, formulación, dosificación y absorción. Por lo tanto, es muy importante analizarla en una fase temprana del proceso de descubrimiento de fármacos para evitar la realización de pruebas ADME de compuestos de baja solubilidad, que son costosas y requieren mucho tiempo.

Tradicionalmente, los ensayos de solubilidad en equilibrio se han determinado con un rendimiento limitado, agitando e incubando el compuesto con un disolvente durante al menos 24 horas, antes de la filtración y la determinación de la concentración por HPLC. Este enfoque ya no cumple los requisitos del descubrimiento de fármacos moderno.

Hoy en día,las pruebas cinéticas de solubilidad automatizadas realizadasen nefelómetros de microplaca ofrecen un mayor rendimiento en menos tiempo. En este método, se prepara una dilución en serie del compuesto que se va a analizar en una solución acuosa y se pipetea en una microplaca. El precipitado no disuelto se detecta por dispersión de la luz. A concentraciones elevadas, el compuesto precipitará enturbiando la suspensión y proporcionando recuentos elevados de RNU. Mientras la concentración sea superior a la solubilidad, el compuesto precipitará. Cuando la concentración sea inferior a la solubilidad, el compuesto se disolverá completamente dando lugar a una solución clara. En consecuencia, la dispersión y los recuentos de RNU se reducirán significativamente. Normalmente, se aplican a los datos dos ajustes lineales para las fases soluble e insoluble. El punto en el que se cruzan se toma como punto de solubilidad cinética (fig. 10).

Las ventajas de este enfoque son la rapidez del ensayo y la facilidad de manejo. Los ensayos nefelométricos basados en microplacas sólo requieren pasos de pipeteo; no es necesaria la filtración ni la separación de fases de la solución del residuo no disuelto. Además, no se requiere ningún paso de transferencia de líquido, ya que la preparación del ensayo y su medición pueden realizarse en la misma microplaca. Por último, puede emplearse para determinar tanto la concentración a la que un compuesto se vuelve soluble como el punto en el que un soluto empieza a precipitar.

Normalmente, la señal detectada es lineal para hasta 3 órdenes de magnitud de concentración de partículas y puede alcanzarse un límite de detección de unos 20 mmol/L para ensayos de solubilidad cinética.⁸

Crecimiento microbiano

La nefelometría basada en microplacas también puede utilizarse como alternativa a la detección del crecimiento microbiano basada en la absorbancia OD600. A medida que las bacterias se multiplican, el número de células que fluctúan en la solución aumentará, incrementando así los niveles de dispersión y los recuentos de RNU. Generalmente se utiliza una dilución en serie del cultivo para relacionar la densidad óptica con los recuentos de RNU. El enfoque nefelométrico es comparable al basado en la absorbancia, pero suele tener una mayor sensibilidad.

Las notas de aplicación Monitoreo de curvas de crecimiento microbiano por nefelometría láser y Monitoreo nefelométrico del crecimiento de Candida albicans (fig.11) muestran cómo las curvas de crecimiento pueden ser medidas eficientemente en el NEPHELOstarPlus.