CLARIOstar Plus
Most flexible Plate Reader for Assay Development
Was ist Fluoreszenzintensität?
Die Fluoreszenz basiert auf der Photolumineszenz, einem Prozess des Glühens und der Lichtemission. Es handelt sich um einen physikalischen Prozess, bei dem Licht emittiert wird, nachdem es von einer Substanz absorbiert wurde. Die Fluoreszenzintensität gibt an, wie viel Licht (Photonen) emittiert wird. Sie ist das Ausmaß der Emission und hängt von der Konzentration des angeregten Fluorophors ab.
Fluoreszenz entsteht durch die Absorption von Energie (Licht) durch fluoreszierende Moleküle, sogenannte Fluorophore. Durch die absorbierte Energie werden die Elektronen auf ein höheres Energieniveau angehoben. Da dieser angeregte Zustand instabil ist, fallen die Elektronen in den Grundzustand zurück und emittieren dabei Licht (Abb. 1).
Ein kleinerer Teil der absorbierten Photonen wird in Bewegung und Wärme umgewandelt. Die Energie, die beim Zurückfallen der Elektronen freigesetzt wird, ist also immer kleiner als die Energie, die zur Anregung des Elektrons benötigt wird. Da höherwellige Strahlung weniger energiereich ist als kurzwellige Strahlung, hat die Emission immer eine höhere Wellenlänge als das Licht, das zur Anregung verwendet wurde. Der Abstand zwischen Anregungs- und Emissionsmaxima (Peaks) wird als Stokes-Verschiebung bezeichnet (Abb. 2).1
Die Eigenschaft, dass das Anregungslicht (Absorptionslicht) eine geringere Wellenlänge hat als das Emissionslicht, eröffnet die Möglichkeit, die Fluoreszenzintensität für analytische Zwecke zu nutzen. Fluorophore können nachgewiesen werden, indem sie bei einer bestimmten Wellenlänge angeregt und ihre Emissionsintensität bei einer höheren Wellenlänge gemessen wird. Die Fluoreszenzintensität ist linear mit der Konzentration des angeregten Fluorophors korreliert und eignet sich folglich für quantitative Analysen.
Die Fluoreszenzintensität wird in den Biowissenschaften häufig eingesetzt: in der Mikroskopie zur Lokalisierung und Quantifizierung von Biomolekülen, in der Durchflusszytometrie zur Analyse von Zellen und in mikroplattenbasierten Assays zur Quantifizierung von Molekülen, enzymatischen Aktivitäten und sogar der Interaktion zwischen Molekülen. Diese Seite befasst sich mit der Verwendung der Fluoreszenzintensität in Mikroplatten-Assays, wie sie nachgewiesen wird, was bei der Messung der Fluoreszenzintensität zu beachten ist und welche Assays üblicherweise verwendet werden.
Fluorophore
Ein Fluorophor (auch Fluorochrom) ist eine fluoreszierende Verbindung, die bei Anregung durch Licht Licht emittieren kann. Es sind Tausende von Molekülen bekannt, die fluoreszierende Eigenschaften aufweisen.2 Sieunterscheiden sich durch:
Molekülgröße
Viele Fluorophore sind chemische Verbindungen mit einer geringen Molekülgröße, die sich leicht mit anderen Molekülen verbinden lassen. Fluoreszierende Proteine wie grün oder rot fluoreszierende Proteine (GFP oder RFP) haben eine größere Molekülgröße und können von Zellen exprimiert werden. Sie werden zur Markierung von Proteinen für Expressionsstudien, für endogen exprimierte Biosensoren oder einfach als Marker zur Zellquantifizierung verwendet. Lesen Sie hier, wie die Transfektionseffizienz auf der Basis vonGFP und mcherry mit dem VANTAstar genau überwacht werden kann.
Anregungs- und Emissionswellenlängen
Die Anregungs- und Emissionscharakteristika eines Fluorophors werden als Spektren dargestellt: In einem Koordinatensystem werden Nanometer auf der x-Achse und die Intensität auf der y-Achse angegeben. Die Kurven sind auf 100% normiert und ermöglichen eine schnelle Identifizierung der maximalen Anregungs- und Emissionswellenlängen sowie der Stokes-Verschiebung. Diese Informationen sind wichtig, um das richtige Fluorophor für einen Assay auszuwählen. Er muss mit dem Detektionssystem, einer möglichen Autofluoreszenz und anderen Fluorophoren kompatibel sein, wenn mehrere in einem Experiment verwendet werden.
Quantenausbeute
Die Quantenausbeute ist ein Maß dafür, wie effizient ein angeregtes Molekül absorbierte Photonen in Emissionslicht umwandelt. In Kombination mit dem Ausmaß der Lichtabsorption (Extinktionskoeffizient) gibt die Quantenausbeute einen Hinweis auf die Helligkeit eines Fluorophors.
FRET-Paare bestehen aus zwei Fluorophoren
FRET (Förster's Resonance Energy Transfer) beschreibt die Energieübertragung von einem Donor-Fluorophor auf ein Akzeptor-Fluorophor. Der Transfer findet statt, wenn der Akzeptor durch das vom Donor kommende Emissionslicht angeregt wird, und zwar nur dann, wenn sich beide Fluorophore in unmittelbarer Nähe befinden. FRET wird häufig für molekulare Bindungsstudien oder in Biosensoren verwendet. Letztere ändern ihre Konformation, wenn der Analyt bindet und die beiden Fluorophore zusammenbringt. Damit FRET stattfinden kann, muss das Fluorophorpaar eine Überlappung zwischen dem Donor-Emissionsspektrum und dem Akzeptor-Anregungsspektrum aufweisen.3
Nachweis der Fluoreszenzintensität
Auch wenn sich die Fluorophore voneinander unterscheiden, ist die Grundlage für die Messung der Fluoreszenzintensität in Mikrotiterplatten dieselbe (Abb. 4):
- Breitbandiges Licht wird von einer Lichtquelle erzeugt.
- Der Anregungswellenlängenbereich wird aus dem breitbandigen Licht gefiltert
- Der Anregungswellenlängenbereich regt das Fluorophor an
- Der Emissionswellenlängenbereich wird aus dem Emissionslicht herausgefiltert
- Ein Detektor quantifiziert das gefilterte Emissionslicht
Im Gegensatz zur Absorption handelt es sich bei der Fluoreszenz nicht um eine absolute Messung. Die Intensität des Fluoreszenzsignals ist in der Regel relativ zu anderen Messungen oder zu einer von einem Gerät vorgenommenen Referenzmessung. Folglich messen Fluoreszenzplatten-Lesegeräte das von einer Probe emittierte Lichtsignal in Relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU).
Lichtquellen
Es gibt drei gängige Lichtquellen, die in Mikroplatten-Readern verwendet werden. Unabhängig davon, mit welcher Lichtquelle Ihr Lesegerät ausgestattet ist, kann deren Leistung die Messergebnisse beeinflussen. Lesen Sie mehr in der HowTo Note: Wie beeinflusst die Anzahl der Blitze die Messergebnisse?
Xenon-Blitzlampe
Xenon-Blitzlampen emittierenLicht im Bereich von 200 nm bis 2500 nm. Sie eignen sich daher für die Anregung aller Moleküle, die Licht vom UV- bis zum Infrarotbereich absorbieren. Sie weisen eine hohe Signalleistung auf und sind langlebig. Aufgrund dieser Vorteile werden Xenon-Blitzlampen als Fluoreszenz-Anregungsquellen in BMG LABTECH Plattenreadern eingesetzt.
Wolfram-Halogen-Lampe
Halogenlampen emittieren Licht ab ca. 360 nm und sind für die Messung der UV-Fluoreszenzintensität nicht geeignet. Im Vergleich zu Xenon-Lampen haben Wolfram-Lampen eine kürzere Lebensdauer, eine geringere Ausgangsintensität und führen zu einer geringeren Empfindlichkeit, wenn sie für die Fluoreszenzdetektion in Mikroplatten-Readern verwendet werden.
LEDs
Leuchtdioden (LEDs) emittieren Licht mit hoher Intensität, aber nur mit einer bestimmten Bandbreite. Dementsprechend sind mehrere Dioden für verschiedene Anregungswellenlängen erforderlich, was den flexiblen Nachweis mehrerer Fluorophore komplizierter und teurer macht.
Auswahl der Wellenlänge
Breitbandige Anregungsquellen können weite Wellenlängenbereiche abdecken, vom UV bis zum Infrarotlicht. Um den interessierenden Fluorophor spezifisch anzuregen und unspezifische Signale zu vermeiden, muss das breitbandige Anregungslicht so ausgewählt (gefiltert) werden, dass nur Licht um das Anregungsmaximum des Fluorophors übertragen wird. In ähnlicher Weise wird das Emissionslicht auf das Emissionsmaximum des Fluorophors gefiltert. Auf diese Weise wird nur die vom interessierenden Fluorophor stammende Fluoreszenz zum Detektor geleitet. Dementsprechend wird die Empfindlichkeit des Assays durch die Optimierung des Wellenlängenbereichs verbessert.
Die Nachweisempfindlichkeit einiger Mikroplatten-Lesegeräte mit Fluoreszenzintensität wird durch die Verwendung einer zusätzlichen Auswahl zwischen Anregung und Emission verbessert: einem dichroitischen Spiegel. Der dichroitische Spiegel lässt in der Regel Licht oberhalb einer bestimmten Wellenlänge durch, blockiert aber Licht bei niedrigeren Wellenlängen. Der Cut-off liegt zwischen Anregung und Emission und sorgt für ein geringeres Durchsickern von Anregungslicht zum Detektor.
Filter
Optische Filter sinddünne runde oder rechteckige Glasplättchen mit einer optischen Beschichtung. Die Beschichtung lässt nur Licht einer bestimmten Wellenlänge durch. Fluorophore mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionsmaxima benötigen unterschiedliche Filter. Ein Filter wird in der Regel nach der mittleren Transmissionswellenlänge benannt, die oft das Anregungs- oder Emissionsmaximum des Fluorophors darstellt. Außerdem hat ein optischer Filter eine bestimmte Bandbreite (oder Bandpass), die angibt, wie breit der Transmissionsbereich ist. So filtert beispielsweise ein 485-nm-Filter mit einer Bandbreite von 10 nm weißes Licht im Bereich zwischen 480 und 490 nm.
Monochromatoren
Im Gegensatz zu optischen Filtern sind Monochromatoren in der Lage, je nach Anforderung Licht verschiedener Wellenlängen zu selektieren. In Mikroplatten-Lesegeräten werden zwei Arten von Monochromatoren verwendet: herkömmliche Monochromatoren auf Gitterbasis oder lineare Monochromatoren mit variablem Filter. Bei gitterbasierten Monochromatoren werden die Wellenlängen durch Beugung des weißen Lichts in seine Farben ausgewählt. Die Wellenlängen werden dann durch einen Spalt ausgewählt, der unerwünschtes Licht physisch blockiert und nur das gewünschte durchlässt. Der Nachteil der Gittermethode ist die geringe Lichtdurchlässigkeit und das Auftreten von Streulicht, das den Detektor erreichen kann und die Gesamtempfindlichkeit der Fluoreszenz verringert.
Der lineare variable Filter (LVF) Monochromator überwindet das Streulichtproblem, da er das Licht nicht bricht, sondern regelrecht filtert. Der LVF-Monochromator verwendet zwei Objektträger mit einer Gradientenbeschichtung. Durch Verschieben der beiden linearen Filter gegeneinander kann jede Wellenlänge mit beliebiger Bandbreite ausgewählt werden. Der LVF-Monochromator hat eine filterähnliche Transmission, eliminiert Streulicht und hat somit eine bessere Leistung als Beugungsmonochromatoren (Abb. 6). Die Verwendung linearer variabler Filter in Mikroplatten-Readern ist eine patentierte Technologie von BMG LABTECH.
Detektor
Die Fluoreszenzintensität in Mikroplatten-Readern wird mit Photomultipliern (PMTs) erfasst. Sie vervielfachen das Signal mit Hilfe des photoelektrischen Effekts und wandeln das Licht in ein elektrisches Signal um. Für die Messung der Fluoreszenzintensität in Mikroplatten-Readern werden zwei verschiedene PMTs verwendet, die sich in ihrem empfindlichen Wellenlängenbereich unterscheiden. Ein rauscharmer blau/grüner PMT ist im Bereich bis 740 nm empfindlich und wird oft auch für Lumineszenzmessungen verwendet. Eine rotverschobene PMT misst die Fluoreszenz empfindlich bis 900 nm und deckt damit auch rote und infrarote Farbstoffe ab. Diese werden häufig für zellbasierte Messungen verwendet , da die Autofluoreszenz in diesem Wellenlängenbereich reduziert ist.
So richten Sie eine Fluoreszenzmessung an einem Plattenlesegerät ein
Mikroplatte
Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität erfordert eine schwarze Platte, da sie den Hintergrund und die Reflexion des Anregungslichts reduziert. Weitere Einzelheiten zur Wahl der Platte finden Sie in unserem Blogbeitrag"Die Mikroplatte: Nutzen in der Praxis".
Filter- und Monochromatoreinstellungen
Die Wahl des richtigen Filters ist entscheidend für eine präzise Bestimmung der Fluoreszenzintensität. Wie bereits erwähnt, sollten die mittleren Wellenlängen bei oder nahe dem Anregungs- und Emissionsmaximum liegen. Es gibt jedoch einige Dinge, die zu beachten sind:
a) Abstand zwischen den Filtern
Wenn die Ränder der Anregungs- und Emissionsfilter zu nahe beieinander liegen, kann das Anregungslicht durchdringen und den Detektor erreichen. Dann verschwindet das Signal des Fluorophors im Anregungslicht und ist nicht mehr messbar. Wie nahe die Filter beieinander liegen können, hängt von der Qualität der Filter und von der Verwendung eines dichroitischen Spiegels ab. In der Regel sollten die höchste transmittierte Anregungswellenlänge und die niedrigste transmittierte Emissionswellenlänge 30 nm voneinander entfernt sein (Abb. 7).
b) Bandbreite
Der Bandpass von Filtern variiert von einigen Nanometern bis zu 100 nm. Der Bandpass wirkt sich auf die Lichtmenge aus, die den Filter passieren kann. Filter mit geringer Bandbreite (~10 nm) werden für helle Fluorophore oder für komplexe Proben mit starker Autofluoreszenz empfohlen. Ein typisches Beispiel sind grüne Fluorophore wie AlexaFluor488, FITC oder GFP in einer zellulären Umgebung.
Filter mit größerer Bandbreite werden für Fluorophore mit geringer Emission empfohlen, wenn sie in einem Bereich emittieren, in dem die Autofluoreszenz gering ist (Emission <600nm), oder wenn der Puffer keine andere fluoreszierende Verbindung enthält. BMG LABTECH wählt die Filter auf der Grundlage der Anregungs- und Emissionsspektren der Fluorophore aus. Zusätzlich werden Filterpaare vermessen und aufeinander abgestimmt, so dass Sie sicher sein können, dass Sie die bestmöglichen Filter erhalten. Standardeinstellungen für gängige Fluorophore sind ebenfalls bereits für den Monochromator gespeichert, so dass diese Auswahlarbeit nicht dem Forscher überlassen wird.
c) FRET-Messungen erfordern zwei Emissionskanäle
Die obigen Überlegungen gelten auch für FRET-Messungen. Es ist jedoch zu beachten, dass zwei Emissionen getrennt erfasst werden müssen. Das angeregte Donor-Fluorophor emittiert Licht mit einer bestimmten Wellenlänge, wenn kein Akzeptor in der Nähe ist. Befindet sich ein Akzeptor-Fluorophor in der Nähe, überträgt der Donor die Energie auf den Akzeptor, der dann Licht mit einer höheren Wellenlänge aussendet. Dies bedeutet, dass zwei Emissionsfilter erforderlich sind, von denen einer nur die Donor-Emission und der andere nur die Akzeptor-Emission durchlässt.
Verstärkung
Die Fluoreszenzverstärkung istein Verstärkungsfaktor, genauer gesagt die Spannung des Detektors, bei der das eingehende Lichtsignal verstärkt wird. Durch Änderung der Verstärkung wird der dynamische Bereich der Detektion entlang der Konzentrationskurve des Analyten/Tests verschoben. Die Breite des dynamischen Bereichs ist jedoch fest und ändert sich nicht.
Schwache Signale benötigen eine große Verstärkung (hohe Verstärkung), und helle Signale benötigen weniger Verstärkung (geringe Verstärkung). Eine falsch gewählte Verstärkung kann Messdaten unbrauchbar machen, weil sie entweder den Messbereich überschreiten oder Unterschiede nicht mehr aufgelöst werden. Daten, die diese Auswirkungen verdeutlichen, finden Sie in der HowTo-Note: Wie optimiert man die Verstärkungseinstellung des Mikroplatten-Lesegeräts? Die Verstärkung wird normalerweise so eingestellt, dass die maximale Messleistung bei der Probe mit der erwarteten höchsten Intensität erreicht wird. Dies geschieht, um ein möglichst großes dynamisches Fenster zwischen dem höchsten und dem niedrigsten Messwert zu erhalten (Abb. 8).
Alle BMG LABTECH Mikroplatten-Reader ermitteln die Verstärkung automatisch, sofern eine bestimmte Vertiefung mit einer bestimmten Signalintensität identifiziert wird. Beim CLARIOstarPlus und VANTAstar ist jedoch keine Verstärkungseinstellung erforderlich. Die Enhanced Dynamic Range (EDR)-Technologiewurde speziell entwickelt, um den größtmöglichen Dynamikbereich zu bieten - 8 Konzentrationsdekaden. Dies bietet Forschern einen noch nie dagewesenen Komfort bei Mikroplattenmessungen, da äußerst zuverlässige Ergebnisse über einen großen dynamischen Bereich ohne manuelle Eingriffe gemessen werden können.
Fokale Höhe
Die Höhe, in der ein Signal erfasst wird, hat einen erheblichen Einfluss auf die Empfindlichkeit der Messung. Die Messung in einer nicht optimalen Brennpunkthöhe kann das Signal um bis zu 90 % verringern. So müssen z. B. anhaftende fluoreszierende Zellen in der Nähe des Plattenbodens gemessen werden, während bei einer homogenen fluoreszierenden Lösung das höchste Signal knapp unter der Flüssigkeitsoberfläche entsteht und vom Füllvolumen der Vertiefung abhängt. Einige Plattenlesegeräte bestimmen die optimale Fokushöhe in einer ausgewählten Vertiefung. Der CLARIOstar® Plusund der VANTAstar® gehensogar noch weiter und bestimmen die Fokushöhe automatisch während des Lesens einer Platte.
Fluoreszenzassays - Wofür wird die Fluoreszenzintensität verwendet?
Die Zahl der Fluoreszenzassays ist so groß wie die Zahl der biologischen und chemischen Fragen, die sie beantworten können. Daher werden im Folgenden die häufigsten Anwendungen auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität skizziert.
Assays für Zelllebensfähigkeit und Zytotoxizität
Ob Zellen durch einen Wirkstoff geschädigt werden oder Krebszellen bei der Behandlung absterben, sind häufige Fragen, die mit Fluoreszenz- und Zytotoxizitätstests und Mikroplattenlesegeräten beantwortet werden. Beim alamarBlue™-Assay wird Resazurin von stoffwechselaktiven Zellen zu einem Fluorophor reduziert und gibt Auskunft über die Lebensfähigkeit der Zellen. Eine weitere Möglichkeit zur Bewertung der Lebensfähigkeit von Zellen ist der Einbau von fluoreszierend markierten Nukleosiden in die DNA. Diese werden in die DNA eingebaut und fluoreszieren folglich nur, wenn eine DNA-Replikation stattfindet, ein Marker für die Lebensfähigkeit.
Eine Möglichkeit, den Zelltod anhand der Fluoreszenzintensität zu erkennen, basiert auf fluoreszierenden DNA-Farbstoffen wie SYBR® Greenoder Celltox™ Green. Die Farbstoffe sind nicht zellpermeabel, werden aber in Lösung mit der DNA in Kontakt gebracht, wenn die Zellmembran während des Zelltods beschädigt wird, und beginnen dann zu fluoreszieren (Abb. 9). Diese Assays sind mit Echtzeitmessungen kompatibel und können die Zellgesundheit über einen längeren Zeitraum überwachen. Da diese Messungen über Tage hinweg durchgeführt werden, muss die Mikroplattenkammer bei 37 °C und 5 %CO2 bebrütet werden, damitdie Zellen zufrieden sind. Der CLARIOstar Plus mit Atmosphärenkontrolleinheit bietet nachweislichdie ideale Atmosphäre für zellbasierte Langzeitexperimente. Weitere Zellgesundheitstests finden Sie in unserem Blogbeitrag "Zelllebensfähigkeitstests - Messen Sie, wie glücklich Ihre Zellen sind".
Assays für Enzymaktivität
Da Enzyme an zahlreichen biologischen Prozessen beteiligt sind, ist es wichtig zu untersuchen, wie Inhibitoren oder Promotoren die Enzymaktivitäten beeinflussen. Die Prinzipien von Enzymtests sind vergleichbar: Sie verwenden ein vorfluoreszierendes Substrat, das bei der Verarbeitung durch das Enzym ein Fluorophor freisetzt. Gängige Fluorophore basieren auf Cumarin-Derivaten, wie z. B. im fluoreszenzbasierten Assay des epigenetischen Enzyms Histon-Deacetylase 1 (HDAC1), wo sie zur Untersuchung der Hemmung von Histon-Deacetylasen verwendet werden können.
Ein zweites Fluorophor, das in Enzymtests verwendet wird, ist 4-Methylumbelliferon. Ein Beispiel findet sich in der Anwendungsnotiz "CLARIOstar determines activity of a moss-produced human acid alpha-glucosidase (GAA) in a fluorescence-based assay". Das Multimode-Mikroplattenlesegerät CLARIOstarPlus macht die Analyse fluoreszierender Enzymaktivitäten einfach. Die Enhanced Dynamic Range-Technologie ermöglicht das Ablesen über einen Dynamikbereich von 8 Dekaden. Auf diese Weise kann das ansteigende Signal in Enzymaktivitäts-Assays einfach erfasst werden, ohne dass das Risiko besteht, eine falsche Verstärkung zu wählen oder das Gerät zeitaufwändig zu optimieren. Das Gerät wird mit einer kostenlosen Analysesoftware mit integrierter enzymkinetischer Analyse geliefert, die die Michaelis-Menten- und Lineweaver-Burk-Modellierung abdeckt(enzymkinetische Messungen auf einem BMG LABTECH Mikroplattenleser).
Konformationsänderungen: Faltung und Entfaltung von Proteinen
Die Fluoreszenz von natürlich vorkommenden Aminosäuren wie Tryptophan kann auch zur Messung von Konformationsänderungen und der Enzymaktivität von Proteinen verwendet werden. Einige Anwendungsbeispiele sind in unserem Blogbeitrag Tryptophan-Fluoreszenz: Die Sonde der Natur beschrieben. Die Tryptophanfluoreszenz eignet sich beispielsweise für die Suche nach neuen Therapeutika für Arzneimittelziele wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, eines der beliebtesten Ziele für heute auf dem Markt zugelassene Arzneimittel.
Protein-Aggregationstests
Proteine aggregieren, wenn sie falsch gefaltet sind, und die Aggregation korreliert mit Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson und der Prionenerkrankung. Die Analyse der Bildung molekularer Aggregate hilft bei der Diagnose und dem Verständnis dieser Krankheiten sowie bei der Prüfung potenzieller Arzneimittel. Die beiden Fluorophore Bis-ANS und Thioflavin T (ThT) verstärken ihre Fluoreszenzintensität bei Wechselwirkung mit Proteinaggregaten. Bis-ANS interagiert vorzugsweise mit amorphen Aggregaten, wie in der Applikationsschrift "Einsatz eines BMG LABTECH Mikroplatten-Readers zur Überwachung der Amyloidbildung" beschrieben.
ThT bindet an Fibrillen und wird hauptsächlich in kinetischen Assays verwendet. Enthält die Probe aggregationsfördernde Moleküle, aggregieren die rekombinanten Proteine, und die Fluoreszenz steigt an (Abb. 10).
Die Applikationsschrift "Real-time quaking-induced conversion assay for prion seeding" erläutert, wie der Assay zum Nachweis der Prionenkrankheit Scrapie in Hamsterhirnhomogenaten eingesetzt wird. Da diese Aggregationsassays ein langes Schütteln erfordern, können die Mikroplatten-Reader von BMG LABTECH mit sehr robusten und langlebigen Transportsystemen ausgestattet werden.
