형광 강도(FRET 포함)

형광 강도란 무엇인가요?

형광은 발광과 빛의 방출 과정인 광발광을 기반으로 합니다. 형광은 빛이 물질에 흡수된 후 방출되는 물리적 과정입니다. 형광 강도는 방출되는 빛(광자)의 양을 나타냅니다. 이는 방출의 정도이며 여기된 형광체의 농도에 따라 달라집니다.

형광은 형광 분자가 에너지(빛)를 흡수하여 만들어지는데, 이를 형광체라고 합니다. 흡수된 에너지는 전자를 더 높은 에너지 준위로 끌어올립니다. 이 들뜬 상태는 불안정하기 때문에 전자는 다시 기저 상태로 떨어져 빛을 방출합니다(그림 1).

흡수된 광자의 작은 부분은 운동과 열로 변환됩니다. 따라서 전자가 다시 떨어질 때 방출되는 에너지는 항상 전자를 여기시키는 데 필요한 에너지보다 작습니다. 고파장 복사는 단파장 복사보다 에너지가 적기 때문에 방출은 항상 여기된 빛보다 더 높은 파장을 갖습니다. 여기와 방출 최대치(피크) 사이의 거리를 스토크스 시프트(그림 2)라고 합니다.¹

형광 강도 감지

형광물질은 서로 다르지만 마이크로 플레이트에서 형광 강도 측정의 기본은 동일합니다(그림 4):

• 광원에 의해 광대역 광이 생성됩니다.
• 여기 파장 범위는 광대역 광에서 필터링됩니다.
• 여기 파장 범위는 형광체를 여기시킵니다.
• 방출 파장 범위는 방출 광에서 필터링됩니다.
• 검출기는 필터링된 방출 광을 정량화합니다.

흡광도와는 달리 형광은 절대적인 측정값이 아닙니다. 형광 신호의 강도는 일반적으로 다른 측정값이나 기기로 측정한 참조 측정값에 상대적입니다. 따라서형광 판독기는 시료에서 방출되는 광 신호를 상대 형광 단위(RFU)로 측정합니다.

광원

마이크로 플레이트 판독기에 일반적으로 사용되는 광원은 세 가지입니다. 리더에 장착된 광원에 관계없이 광원의 성능은 측정 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 자세한 내용은 방법 노트: 플래시 횟수가 측정 결과에 어떤 영향을 미칩니까?

제논 플래시 램프

제논 플래시 램프는 200nm~2500nm 범위의 빛을 방출합니다. 따라서 자외선 범위에서 적외선 범위까지 빛을 흡수하는 모든 분자를 여기시키는 데 적합합니다. 높은 신호 출력을 나타내며 수명이 길다. 이러한 장점으로 인해 제논 플래시 램프는 BMG LABTECH 플레이트 리더기에서 형광 여기 소스로 사용됩니다.

텅스텐 할로겐 램프

할로겐 램프는 약 360nm에서 시작하는 빛을 방출하므로 UV 형광 강도를 측정하는 데 적합하지 않습니다. 제논 램프에 비해 텅스텐 램프는 수명이 짧고 출력 강도가 낮으며 마이크로 플레이트 판독기 형광 검출에 사용할 경우 감도가 낮습니다.

LED

발광 다이오드(LED)는 특정 대역폭에서만 높은 강도로 빛을 방출합니다. 따라서 여러 여기 파장에 대해 여러 개의 다이오드가 필요하므로 여러 형광체를 유연하게 감지하는 데 더 복잡하고 비용이 많이 듭니다.

파장 선택

광대역 여기 광원은 자외선부터 적외선까지 넓은 파장 범위를 커버할 수 있습니다. 관심 있는 형광체를 구체적으로 여기시키고 비특이적인 신호를 피하기 위해 광대역 여기광을 선택(필터링)하여 형광체의 여기 최대값 주변의 빛만 투과하도록 해야 합니다. 마찬가지로 방출 광도 형광체의 방출 최대값에 맞게 필터링됩니다. 이렇게 하면 관심 있는 형광체에서 나오는 형광만 검출기로 유도됩니다. 따라서 파장 범위를 최적화하여 분석 감도가 향상됩니다.

일부 형광 강도 마이크로플레이트 판독기의 검출 감도는 여기와 방출 사이에서 추가 선택 사항인이색 거울을 사용하여 향상됩니다. 이색 거울은 일반적으로 특정 파장보다 높은 파장의 빛은 투과하지만 낮은 파장의 빛은 차단합니다. 이 차단은 여기와 방출 사이에 위치하며 여기 빛이 감지기로 누출되는 것을 줄여줍니다.

필터

광학필터는 광학 코팅이 된 얇은 원형 또는 직사각형 유리 슬라이드입니다. 코팅은 특정 파장의 빛만 투과시킵니다. 여기 및 방출 최대값이 다른 형광체는 다른 필터가 필요합니다. 필터는 일반적으로 형광체의 여기 또는 방출의 최대값인 중간 투과 파장의 이름을 따서 명명됩니다. 또한 광학 필터에는 대역폭(또는 대역 통과)이 정의되어 있으며, 이는 전송 범위가 얼마나 넓은지를 나타냅니다. 예를 들어, 대역폭이 10nm인 485nm 필터는 480~490nm 범위의 백색광을 필터링합니다.

모노크로메이터

 광학 필터와 달리 모노크로메이터는 요구 사항에 따라 다양한 파장의 빛을 선택할 수 있습니다. 마이크로 플레이트 리더기에는 기존의 격자 기반 모노크로메이터 또는 선형 가변 필터 모노크로메이터의 두 가지 유형의 모노크로메이터가 사용됩니다. 격자 기반 모노크로메이터에서는 백색광의 회절에 의해 파장이 색상으로 선택됩니다. 그런 다음 원하지 않는 빛을 물리적으로 차단하고 원하는 빛만 투과시키는 슬릿을 통해 파장을 선택합니다. 격자 방식의 단점은 빛 투과율이 낮고 미광이 발생하여 검출기에 도달하여 전체적인 형광 감도가 낮아질 수 있다는 것입니다.

b) 대역폭

필터의 대역 통과는 수 나노미터에서 최대 100nm까지 다양합니다. 대역폭은 필터를 통과할 수 있는 빛의 양에 영향을 미칩니다. 밝은 형광물질이나 자가 형광이 높은 복잡한 샘플에는 저대역폭 필터(~10nm)를 사용하는 것이 좋습니다. 대표적인 예로 세포 환경의 AlexaFluor488, FITC 또는 GFP와 같은 녹색 형광체가 있습니다.

자가 형광이 낮은 범위(방출 <600nm)에서 방출되거나 버퍼에 다른 형광 화합물이 포함되어 있지 않은 경우 저방출 형광물질에는 더 넓은 대역폭 필터를 사용하는 것이 좋습니다. 비엠지랩텍은 형광물질 여기 및 발광 스펙트럼을 기반으로 필터를 선택합니다. 또한 필터 쌍을 측정하고 서로 매칭하여 최상의 필터를 받을 수 있도록 합니다. 일반적인 형광체에 대한 기본 설정도 모노크로메이터에 이미 저장되어 있으므로 이 선택 작업을 연구자에게 맡기지 않아도 됩니다.

c) FRET 측정에는 두 개의 방출 채널이 필요합니다.

위의 고려 사항은 FRET 측정에도 적용됩니다. 그러나 두 개의 방출을 별도로 기록해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 여기된 기증 형광체는 근처에 억셉터 형광체가 없으면 특정 파장에서 빛을 방출합니다. 억셉터 형광체가 가까이 있으면 공여체는 에너지를 억셉터로 전달하여 더 높은 파장에서 빛을 방출합니다. 즉, 두 개의 방출 필터가 필요하며, 그 중 하나는 도너 방출만 허용하고 다른 하나는 억셉터 방출만 전송할 수 있습니다.

이득

형광 게인은 증폭 계수, 더 정확하게는 들어오는 빛 신호가 증폭되는 검출기의 전압입니다. 게인을 변경하면 분석물/분석의 농도 곡선을 따라 동적 검출 범위가 이동합니다. 그러나 동적 범위의 폭은 고정되어 있으며 변경되지 않습니다.

약한 신호는 큰 증폭(높은 게인)이 필요하고, 밝은 신호는 적은 증폭(작은 게인)이 필요합니다. 게인을 잘못 선택하면 측정 범위를 초과하거나 차이가 더 이상 해결되지 않아 측정된 데이터를 사용할 수 없게 될 수 있습니다. 이러한 효과를 강조하는 데이터는 사용법 노트: 마이크로플레이트 판독기의 게인 설정을 최적화하는 방법에서 확인할 수 있습니다. 게인은 일반적으로 예상되는 최고 강도의 샘플에 대해 최대 측정 출력을 갖도록 설정됩니다. 이는 최고 측정값과 최저 측정값 사이에 가능한 가장 큰 동적 창을 갖기 위해 수행됩니다(그림 8).

특정 신호 강도를 가진 특정 웰이 식별되면 모든 BMG LABTECH 마이크로플레이트 판독기는 자동으로 게인을 결정합니다. 그러나 CLARIOstar Plus플 VANTAstar 게인 조정이 필요하지 않습니다. 향상된다이나믹 레인지(EDR) 기술은가능한 가장 큰 다이나믹 레인지인 8농도를 제공하도록 특별히 설계되었습니다. 이를 통해 연구자들은 수동 개입 없이 넓은 동적 범위에서 매우 신뢰할 수 있는 결과를 측정할 수 있으므로 마이크로플레이트 측정에 있어 전례 없는 편리함을 누릴 수 있습니다.

초점 높이

신호가 감지되는 높이는 측정 감도에 큰 영향을 미칩니다. 최적의 초점 높이가 아닌 곳에서 측정하면 신호가 최대 90%까지 감소할 수 있습니다. 예를 들어, 부착형 형광 세포는 플레이트 바닥 가까이에서 측정해야 하는 반면, 균질 형광 용액은 액체 표면 바로 아래에서 가장 높은 신호를 나타내며 웰의 충전량에 따라 달라집니다. 일부 플레이트 판독기는 선택한 웰에서 최적의 초점 높이를 결정합니다. ^{클라리오스타®} 플러스와^{밴타스타®는} 한 단계 더 나아가플레이트를 판독하는 동안 자동으로 초점 높이를 결정합니다.

형광 분석 - 형광 강도는 무엇에 사용되나요?

형광 분석의 수는 답변할 수 있는 생물학적 및 화학적 질문의 수만큼이나 많습니다. 따라서 형광 강도를 기반으로 하는 가장 일반적인 애플리케이션은 다음과 같습니다.

세포 생존력 및 세포 독성 분석

화합물에 의해 세포가 손상되는지 또는 치료 시 암세포가 죽는지는 형광 생존력 및 세포 독성 분석과 마이크로플레이트 판독기로 해결할 수 있는 일반적인 질문입니다.알라마르블루™ 분석에서 레사주린은 대사 활성 세포에 의해 형광물질로 환원되어 세포 생존력을 보고합니다. 세포 생존력을 평가하는 또 다른 방법은 형광으로 표시된 뉴클레오시드를 DNA에 통합하는 것입니다. 뉴클레오사이드는 DNA 복제가 일어날 때만 형광을 내며, 이는 생존력을 나타내는 지표가 됩니다.

형광 강도로 세포 사멸을 감지하는 방법은 SYBR^® Green또는 Celltox™ Green과 같은 형광 DNA 염료를 기반으로 합니다. 이 염료는 세포 투과성이 없지만 세포 사멸 중에 세포막이 파괴될 경우 용액 속의 DNA에 노출되어 형광을 발산하기 시작합니다(그림 9). 이러한 분석은 실시간 측정과 호환되며 시간에 따른 세포 상태를 모니터링할 수 있습니다. 이러한 측정은 며칠에 걸쳐 이루어지기 때문에 세포를 건강하게 유지하기 위해마이크로플레이트 챔버를 37°C에서 5% CO_2로 배양해야 합니다.대기 제어 장치가 포함된 CLARIOstar Plus는 장기간의 세포 기반 실험에 이상적인 환경을 제공하는 것으로 입증되었습니다. 더 많은 세포 건강 분석에 대한 자세한 내용은 블로그 게시물 "세포 생존력 분석 - 세포의 행복도를 측정하세요".

효소 활성 분석

효소는 여러 생물학적 과정에 관여하기 때문에 억제제나 촉진제가 효소 활동에 어떤 영향을 미치는지 연구하는 것이 중요합니다. 효소 분석의 원리는 효소 처리 시 형광기를 방출하는 사전 형광 기질을 사용한다는 점에서 비슷합니다. 일반적인 형광 발색체는 쿠마린 유도체에 기반하며,후성 유전 효소 히스톤 탈아세틸화 효소 1(HDAC1)의 형광 기반 분석에서와 같이 히스톤 탈아세틸화 효소의 억제를 조사하는 데 사용할 수 있는 형광 유도체가 이에 해당합니다.

효소 분석에 사용되는 두 번째 형광체는 4-메틸룸벨리페론입니다. 애플리케이션 노트 "형광 기반 분석에서 이끼에서 생성된 인간 산 알파-글루코시다제(GAA)의 활성 측정"에서 그 예를 확인할 수 있습니다.다중 모드 마이크로플레이트 판독기인 CLARIOstarPlus 는 형광 효소 활성 분석을 쉽게 해줍니다. 향상된 동적 범위 기술을 통해 8십 년의 동적 범위에서 판독할 수 있습니다. 따라서 잘못된 게인을 선택하거나 시간이 많이 소요되는 기기 최적화의 위험 없이 효소 활성 분석에서 증가하는 신호를 쉽게 기록할 수 있습니다. 이 기기는 Michaelis-Menten 및 Lineweaver-Burk 모델링을 포함하는 통합 효소 동역학 분석이 가능한 분석 소프트웨어를 무료로 제공합니다(BMG LABTECH 마이크로 플레이트 리더에서 수행되는 효소 동역학 측정).

형태 변화: 단백질 접힘과 펼침

트립토판과 같은 자연적으로 발생하는 아미노산의 형광은 단백질의 형태 변화와 효소 활성을 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 몇 가지 응용 사례는 트립토판 형광: 자연의 탐침이라는 블로그 게시물에 설명되어 있습니다. 트립토판 형광은 예를 들어 현재 시장에서 승인된 약물의 가장 인기 있는 표적 중 하나인 G 단백질 결합 수용체와 같은 약물 표적에 대한 새로운 치료제를 선별하는 데 유용합니다.

단백질 응집 분석

단백질은 잘못 접히면 응집되며 응집은 알츠하이머, 파킨슨병, 프리온 질환과 같은 질병과 관련이 있습니다. 분자 응집체의 형성을 분석하면 이러한 질병을 진단하고 이해하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 잠재적인 약물을 테스트하는 데도 도움이 됩니다. 두 가지 형광물질인 비스-ANS와 티오플라빈 T(ThT)는 단백질 응집체와 상호 작용하면 형광 강도가 증가합니다. Bis-ANS는 애플리케이션 노트 "아밀로이드 형성을 모니터링하기 위한 비엠지 랩텍 마이크로 플레이트 리더기 사용"에 설명된 대로 무정형 응집체와 상호작용하는 것이 바람직합니다.

ThT는 피브릴에 결합하며 주로 동역학 분석에 사용됩니다. 시료에 응집 유도 분자가 포함되어 있으면 재조합 단백질이 응집되고 형광이 증가합니다(그림 10).

애플리케이션 노트 "프리온 시딩을 위한 실시간 진동 유도 전환 분석"에서는 햄스터 뇌 동질체에서 프리온 질환 스크래피를 검출하는 데 이 분석법이 어떻게 사용되는지 설명합니다. 이러한 응집 분석에는 장기간의 흔들림이 필요하므로 BMG LABTECH의 마이크로 플레이트 리더기에는 매우 견고하고 내구성이 뛰어난 운반 시스템을 장착할 수 있습니다.