Néphélométrie

Qu'est-ce que la néphélométrie ?

La néphélométrie (du grec nephelo : nuage) est une technique de chimie analytique utilisée pour mesurer la turbidité ou le trouble d'une solution causé par la présence de particules insolubles en suspension.

Lorsqu'elle est dirigée à travers une solution trouble contenant des particules solides en suspension, la lumière est transmise, absorbée (bloquée) et diffusée (réfléchie par les particules ; fig.1). La quantité de lumière diffusée dépend de la taille, de la forme et de la concentration des particules insolubles dans la solution, ainsi que de la longueur d'onde de la lumière incidente.

Les théories et les concepts sur la diffusion de la lumière ont été élaborés à la fin du 19e et au début du 20e siècle, principalement par Rayleigh, Mie et Debye.

La néphélométrie a d'abord été appliquée dans le domaine de la chimie clinique aux immunodosages pour la détection et la quantification des protéines sériques dans le sang, telles que les immunoglobulines et les macromolécules. Ces applications sont encore utilisées aujourd'hui. Appliquées auxlecteurs de microplaques, elles sont principalement utilisées pour analyser la précipitation des matériaux (fig. 2), comme la solubilité des médicaments et l'agrégation des protéines, ou la croissance bactérienne.

Différence entre néphélométrie et turbidimétrie

La turbidité ou le trouble peut être détecté soit par néphélométrie, soit par turbidimétrie. Ces deux techniques sont non destructives et basées sur la diffusion de la lumière causée par une suspension de particules solides. Bien que ces deux termes soient parfois utilisés comme synonymes, ils ne le sont pas d'un point de vue technique. La turbidimétrie consiste à mesurer la perte d'intensité de la lumière transmise à travers un échantillon, causée par l'effet de diffusion des particules insolubles. Comme l'absorbance, la turbidimétrie quantifie l'intensité de la lumière transmise à travers l'échantillon, en particulier son atténuation. En turbidimétrie, la lumière d'une longueur d'onde connue traverse un échantillon contenant des particules insolubles en solution. Un détecteur placé en ligne avec la source lumineuse recueille la lumière qui traverse l'échantillon (fig. 3A). La diminution de la transmission de la lumière est mesurée par rapport à une référence et la lumière absorbée est quantifiée en unités de densité optique (DO).² En conséquence,la turbidité peut être mesurée par exemple à l'aide d'unlecteur de microplaques d'absorbance.

En revanche, la néphélométrie détermine la turbidité d'une solution en quantifiant directement l'intensité de la lumière diffusée par les particules insolubles de l'échantillon. En général, la lumière diffusée est mesurée à un angle par rapport à la source de lumière incidente, afin d'éviter les interférences de la lumière éventuellement transmise (fig.3B). À cet égard, elle présente des similitudes avec la mesure de l'intensité de la fluorescence.

Néphélométrie et turbidimétrie

Lors de la réalisation d'essais de diffusion de la lumière, le choix entre la néphélométrie et la turbidimétrie est principalement dicté par deux facteurs.

• La concentration de l'échantillon et l'intensité résultante de la lumière diffusée par rapport à l'intensité de la source lumineuse est le facteur le plus important. Si l'échantillon contient un petit nombre de particules insolubles (faibles concentrations), l'intensité de la lumière transmise sera à peu près comparable à l'intensité de la source lumineuse. Dans ce cas, la néphélémétrie est un choix plus approprié. Comme dans l'absorption moléculaire, une petite différence entre deux signaux intenses peut être difficilement déterminée, la turbidimétrie est mieux adaptée lorsque les échantillons contiennent une forte concentration de particules insolubles et que la transmission de la lumière est donc considérablement réduite.

• La taille des particules diffusantes estle deuxième paramètre à prendre en compte, car elle affecte la quantité de lumière réfléchie (bloquée) ou diffusée. La réflexion a lieu lorsque la taille des particules est supérieure à la longueur d'onde de la lumière incidente. Si la taille des particules est comparable ou inférieure à la longueur d'onde de la lumière incidente, il y a diffusion. Par conséquent, la néphélémétrie est la mieux adaptée pour détecter les petites particules, 0,1 - 1 μm étant la taille optimale, car la diffusion prédomine sur la réflexion. La taille des particules est moins importante pour la turbidimétrie, car c'est la diminution relative de la transmission de la lumière qui est détectée. En fait, la détection turbidimétrique reste possible même lorsque la grande taille des particules entraîne une augmentation de la réflexion ou de la réfraction.

Par conséquent, la néphélémétrie est la mieux adaptée et offre une plus grande sensibilité pour l'analyse des petites particules en suspension à de faibles concentrations. La turbidimétrie est généralement appliquée à des particules insolubles relativement grandes et à des concentrations élevées. Par exemple, elle est couramment utilisée en biologie pour déterminer le nombre de cellules (par exemple, des bactéries) dans une solution. 3

Principe de la néphélémétrie

La diffusion de la lumière dans lesliquides suit les règles de la diffusion élastique de la physique des particules, dans laquelle aucune énergie n'est absorbée par l'une ou l'autre des particules au cours de la "collision". L'énergie d'un photon avant et après l'événement de diffusion n'est pas modifiée. La diffusion élastique est différente pour les petites et les grandes particules. Pour les grosses particules, la lumière est diffusée principalement dans la direction avant (angle avant). Lorsque la taille des particules est inférieure à 5 % de la longueur d'onde de la lumière qui les frappe, la diffusion est symétrique.⁴

Les molécules solubles sont généralement de petite taille (par rapport aux longueurs d'onde de la lumière incidente) et se diffusent de manière presque symétrique (fig. 4A). En revanche, les précipités et les complexes en solution ont généralement une taille plus importante (plus proche des longueurs d'onde de la lumière incidente), produisant principalement une diffusion à angle droit (fig.4B). La détection néphélométrique se concentre généralement sur la mesure de la diffusion vers l'avant.

Diffusion et concentration des particules

L'intensité de la lumière diffusée (_IS) et la concentration du précipité (C) sont liées par l'équation suivante :

_IS=_kS*_I0* C

où _kS estune constante déterminée à partir d'un étalonnage du système et _I0 est l'intensité à la source lumineuse.

Les propriétés physiques d'une suspension de particules sont influencées par différentes variables. Bien que la diffusion soit liée à la concentration des particules solides en solution, l'intensité de la lumière diffusée dépend également de leur taille et de leur forme. Des échantillons également concentrés contenant des précipités de tailles différentes présenteront des niveaux de diffusion différents.

En outre, la taille et la forme des précipités sont affectées par la température, le pH et la concentration des réactifs, ainsi que par l'ordre de mélange, l'agitation et l'intervalle entre la formation du précipité et la détection. Pour obtenir des conditions et des résultats reproductibles entre les échantillons et les essais, il est nécessaire de prendre en compte toutes ces variables^{.4, 5}

Longueur d'onde de la source lumineuse

La sélection de la longueur d'onde n'est généralement pas pertinente car l'absorption de la lumière incidente par les particules en suspension n'est généralement pas prise en compte, à condition qu'elle n'induise pas la fluorescence de l'échantillon. Par conséquent, si des échantillons non fluorescents sont utilisés, il n'est pas nécessaire de sélectionner la longueur d'onde. Le choix de la longueur d'onde est basé principalement sur la nécessité de minimiser les interférences potentielles et n'affecte pas l'intensité de la lumière incidente ou de la diffusion elle-même.⁴

L'instrumentation de néphélométrie : comment est-elle détectée ?

Bien que les fluoromètres puissent être utilisés pour la détection néphélométrique, la dépendance angulaire de la diffusion a encouragé le développement d'appareils spécifiques. Les turbidimètres dont les détecteurs sont placés à un angle par rapport au faisceau incident sont appelés néphélomètres et sont considérés comme l'instrument standard pour la mesure des faibles valeurs de turbidité. Ils mesurent l'intensité de la lumière diffusée. La lumière transmise n'est pas détectée.

Les composants de base de cet appareil comprennent une source de lumière, une optique de diffusion de la lumière et un détecteur. La source lumineuse génère un faisceau qui est dirigé à travers l'échantillon. Des lampes halogènes et au xénon ou des lasers peuvent être utilisés comme sources lumineuses. Les lasers sont généralement le choix le plus courant, en raison de leur sensibilité, de leur intensité élevée et de leur nature cohérente (les photons émis sont "en phase" les uns avec les autres). Les longueurs d'onde entrantes et sortantes sont identiques et ne sont donc pas sélectionnées optiquement.

Un détecteur est placé en face de la source lumineuse et à un certain angle par rapport au faisceau lumineux entrant. Il détecte les variations de la diffusion vers l'avant ou de la diffusion latérale, en fonction de sa position. En fonction de l'angle auquel la plus grande partie de la diffusion peut être recueillie, les détecteurs peuvent être placés à des angles de 30°, 70° ou 90°.

La néphélométrie peut être effectuée en tant que point final ou en tant que mesure cinétique. Les mesures de point final quantifient la diffusion maximale de la lumière après qu'une réaction a atteint l'équilibre ou à un moment prédéterminé. La détection cinétique (lectures multiples dans le temps) peut être appliquée tout au long du processus de précipitation et fournit généralement plus d'informations sur la réaction.

Application de la néphélométrie

Depuis les années 1970, l'immunonéphélémétrie est utilisée dans les laboratoires cliniques pour l'analyse des immunodosages. Elle a été utilisée à l'origine pour détecter la formation et la précipitation de complexes immuns (antigène-anticorps), une application qui est encore utilisée aujourd'hui. L'immunonéphélémétrie est également utilisée pour déterminer la concentration des protéines sériques, y compris les immunoglobulines, ainsi que dans les coagulomètres automatisés à haut volume. Ces appareils quantifient les facteurs de coagulation dans les échantillons de sang et permettent d'établir des profils de coagulation à essais multiples.

Dans les laboratoires pharmaceutiques, la néphélométrie est principalement utilisée pour évaluer la solubilité des médicaments ou des composés. En outre, il s'agit d'une méthode prometteuse pour la quantification de la croissance microbienne et elle est couramment utilisée pour déterminer le nombre de cellules dans les suspensions de micro-organismes tels que la levure (par exemple S. cerevisiae).⁶

Néphélémétrie sur microplaque

La néphélométrie peut également être détectée dans des microplaques (fig.5). Ce format est particulièrement avantageux pour les laboratoires des sciences de la vie et l'industrie pharmaceutique, car la manipulation des échantillons et des composés en microplaques augmente à la fois l'efficacité et le rendement. Lesnéphélomètres en microplaques offrent généralementun rendement plus élevé, une approche simplifiée et un faible volume pour la collecte de données sur la turbidité.Le premier dispositif de détection néphélométrique en microplaques basé sur un laser, leNEPHELOstarPlus, a été développé par BMGLABTECH. Cet instrument détecte les particules en solution dans un puits de microplaque en mesurant la lumière diffusée à angle droit générée lorsqu'un faisceau laser est dirigé à travers l'échantillon.

Comme source lumineuse, une diode laser hautement collimatée permet de régler l'intensité et le diamètre du faisceau. Ces caractéristiques réduisent les problèmes de ménisque et optimisent la sensibilité, ce qui permet d'effectuer des mesures dans des plaques de 384 puits.

Dans le NEPHELOstarPlus, le faisceau laser traverse le puits d'échantillon et pénètre dans une sphère d'Ulbricht (sphère d'intégration) placée sous la microplaque. Cette sphère recueille la lumière diffusée incidente en tout point de sa surface intérieure et la distribue également à tous les autres points par des réflexions multiples. La sphère d'Ulbricht recueille la lumière diffusée jusqu'à un angle de 80°, préserve son intensité mais minimise les angles de diffusion originaux, éliminant ainsi l'information spatiale et produisant une lumière diffuse qui peut être quantifiée par le détecteur (fig.6).

Si le faisceau lumineux n'est pas dévié par les précipités présents dans le puits, il passe directement à travers la sphère d'Ulbricht, il n'y a pas de réflexion et, par conséquent, aucun signal n'atteint le détecteur. Si des particules sont présentes dans l'échantillon, la lumière est diffusée, réfléchie à l'intérieur de la sphère d'Ulbricht et finalement mesurée par un détecteur positionné à un angle de 90° par rapport à la lumière incidente (fig.7).

La turbidité est souvent exprimée en UTN (unités de turbidité néphélométrique), en particulier dans les tests de qualité de l'eau. Les valeurs NTU peuvent être dérivées d'un instrument calibré sur la base de mesures comparatives avec des suspensions de formazine de référence. Toutefois, il s'agit d'un processus long et en plusieurs étapes qui nécessite de grands volumes d'échantillons. Le NEPHELOstar Plus quantifie les résultats en unités néphélométriques relatives (RNU). La façon dont les NTU peuvent être comparées aux RNU est décrite dans la note d'application "Improving throughput for assessing nephelometric turbidity units (NTUs) using the NEPHELOstar Plus" (Amélioration du rendement de l'évaluation des unités de turbidité néphélométriques (NTUs) à l'aide du NEPHELOstar Plus). La corrélation entre les deux approches est illustrée à la figure 8.

Qualité des microplaques

Les essais néphélométriques sont généralement réalisés dans des microplaques à 96 ou 384 puits. La qualité optique d'une microplaque est un aspect extrêmement important. Les imperfections telles que la poussière, la saleté, les empreintes digitales ou les rayures sur le fond du puits peuvent disperser la lumière, générant des signaux faussement positifs, réduisant la fenêtre de l'essai ou entraînant une réduction significative de la sensibilité. Par conséquent, les puits présentant des valeurs particulièrement élevées ou des valeurs supérieures à la moyenne du blanc plus deux écarts types ne doivent généralement pas être pris en considération.⁷

Applications de la néphélémétrie en microplaques

La néphélémétrie en microplaques est un outil inestimable pour l'industrie pharmaceutique en raison de son applicabilité dans les criblages de solubilité des composés à haut débit. En outre, elle peut être utilisée pour la croissance microbienne et la cinétique de liaison des protéines, pour mesurer la propension à la calcification dans les fluides corporels, les facteurs rhumatoïdes dans le sérum, la liaison antigène-anticorps (fig. 9), et bien d'autres choses encore.

Essais de solubilité des médicaments

Dans l'industrie pharmaceutique, lecriblage à haut débitest une méthode importante pour la découverte de médicaments. L'évaluation de la solubilité dans ce processus est obligatoire pour déterminer la validité des résultats pharmacologiques et la sélection des composés prometteurs. La solubilité des médicaments a un impact majeur sur la disponibilité, la formulation, le dosage et l'absorption des médicaments. Il est donc très important de l'analyser dès le début du processus de découverte d'un médicament afin d'éviter les criblages ADME coûteux en temps et en argent de composés peu solubles.

Traditionnellement, les essais de solubilité à l'équilibre ont été déterminés avec un débit limité, en agitant et en incubant le composé avec un solvant pendant au moins 24 heures, avant la filtration et la détermination de la concentration par HPLC. Cette approche ne répond plus aux exigences de la recherche moderne de médicaments.

Aujourd'hui, lescribles cinétiques de solubilité automatisés, exécutéssur des néphélomètres à microplaques, permettent d'obtenir un débit plus élevé en moins de temps. Dans cette approche, une dilution en série du composé à tester est préparée dans une solution aqueuse et pipettée sur une microplaque. Le précipité non dissous est détecté par diffusion de la lumière. À des concentrations élevées, le composé précipite, ce qui rend la suspension trouble et entraîne un nombre élevé d'UNR. Tant que la concentration est supérieure à la solubilité, le composé précipite. Lorsque la concentration est inférieure à la solubilité, le composé se dissout complètement, ce qui donne une solution claire. En conséquence, la dispersion et le nombre de RNU seront considérablement réduits. Généralement, deux ajustements linéaires pour les phases soluble et insoluble sont appliqués aux données. Le point où ils se croisent est considéré comme le point de solubilité cinétique (fig.10).

Les avantages de cette approche sont la rapidité de l'essai et la facilité de manipulation. Les essais néphélométriques en microplaques ne nécessitent que des étapes de pipetage ; il n'est pas nécessaire de filtrer ou de séparer la phase de la solution du résidu non dissous. De plus, aucune étape de transfert de liquide n'est nécessaire puisque la préparation de l'essai et sa mesure peuvent être effectuées dans la même microplaque. Enfin, il peut être utilisé pour déterminer à la fois la concentration à laquelle un composé devient soluble et le point auquel un soluté commence à précipiter.

En général, le signal détecté est linéaire jusqu'à 3 ordres de grandeur de la concentration de particules et une limite de détection d'environ 20 mmol/L peut être atteinte pour les essais de solubilité cinétique^.8

Croissance microbienne

La néphélémétrie en microplaques peut également être utilisée comme alternative à ladétection de la croissance microbienne par l'OD600 basée sur l'absorbance.. Au fur et à mesure que les bactéries se multiplient, le nombre de cellules fluctuant dans la solution augmente, ce qui accroît les niveaux de diffusion et le nombre d'UNR. Une dilution en série de la culture est généralement utilisée pour relier la densité optique au nombre d'UNR. L'approche néphélométrique est comparable à l'approche basée sur l'absorbance mais présente généralement une plus grande sensibilité.

Les notes d'applicationMonitoring of microbial growth curves by laser nephelometry etNephelometric monitoring growth of Candida albicans(fig.11) montrent comment les courbes de croissance peuvent être mesurées efficacement sur le NEPHELOstarPlus.