CLARIOstar Plus
Most flexible Plate Reader for Assay Development
Qu'est-ce que l'intensité de la fluorescence ?
La fluorescence est un phénomène de photoluminescence, c'est-à-dire un processus d'émission de lumière après absorption de lumière. Il s'agit d'un processus physique au cours duquel de la lumière est émise après absorption par une substance. L'intensité de la fluorescence indique la quantité de lumière (photons) émise. Elle correspond à l'étendue de l'émission et dépend de la concentration du fluorophore excité.
La fluorescence résulte de l'absorption d'énergie lumineuse par des molécules fluorescentes appelées fluorophores. L'énergie absorbée élève les électrons à un niveau d'énergie supérieur. Cet état étant instable, les électrons retombent à l'état fondamental et émettent de la lumière (voir la figure 1).
Une plus petite partie des photons absorbés est convertie en mouvement et en chaleur. L'énergie libérée lorsque les électrons retombent est donc toujours inférieure à l'énergie nécessaire pour les exciter. Étant donné que les rayonnements à ondes élevées sont moins énergétiques que les rayonnements à ondes courtes, la longueur d'onde de l'émission est toujours supérieure à celle de la lumière utilisée pour l'excitation. La distance entre les maxima d'excitation et d'émission est appelée décalage de Stokes (voir la figure 2).1
Le fait que la lumière d'excitation (absorption) soit à une longueur d'onde inférieure à celle de la lumière d'émission permet d'utiliser l'intensité de la fluorescence à des fins analytiques. Les fluorophores peuvent être détectés en les excitant à une longueur d'onde spécifique, puis en mesurant l'intensité de leur émission à une longueur d'onde plus élevée. L'intensité de la fluorescence est linéairement corrélée à la concentration du fluorophore excité, ce qui la rend adaptée aux analyses quantitatives.
L'intensité de la fluorescence est largement utilisée dans les applications des sciences de la vie : en microscopie pour localiser et quantifier les biomolécules, en cytométrie de flux pour analyser les cellules, et dans les essais en microplaques pour quantifier les molécules, les activités enzymatiques, voire l'interaction entre les molécules. Cette page se concentre sur l'utilisation de l'intensité de la fluorescence dans les essais en microplaques, sur la manière dont elle est détectée, sur les éléments à prendre en compte pour mesurer cette intensité et sur les essais les plus couramment utilisés.
Fluorophores
Un fluorophore (ou fluorochrome) est un composé qui présente des propriétés fluorescentes et qui peut émettre de la lumière lorsqu'il est excité par la lumière. On connaît des milliers de molécules présentant des caractéristiques fluorescentes.2
Leur taille moléculaire
De nombreux fluorophores sont de petites molécules qui peuvent facilement être liées à d'autres molécules. Les protéines fluorescentes, telles que les protéines fluorescentes vertes ou rouges (GFP ou RFP), sont plus grandes et peuvent être exprimées par les cellules. Elles sont utilisées pour marquer des protéines dans le cadre d'études d'expression, pour des biocapteurs exprimés de manière endogène ou simplement comme marqueurs de quantification cellulaire. Découvrez ici comment contrôler avec précision l'efficacité de la transfection basée sur la GFP et le mCherry avec le VANTAstar.
Longueurs d'onde d'excitation et d'émission
Les caractéristiques d'excitation et d'émission de lumière d'un fluorophore sont affichées sous forme de spectres dans un système de coordonnées : les nanomètres sont indiqués sur l'axe des x et l'intensité sur l'axe des y. Les courbes sont normalisées à 100 % et permettent d'identifier rapidement les longueurs d'onde maximales d'excitation et d'émission, ainsi que le décalage de Stokes. Ces informations sont importantes pour choisir le bon fluorophore pour une expérience. Il doit être compatible avec le système de détection, l'autofluorescence potentielle et les autres fluorophores utilisés dans une même expérience.
Rendement quantique
Le rendement quantique est une mesure de l'efficacité avec laquelle une molécule excitée convertit les photons absorbés en lumière d'émission. En combinaison avec la mesure de l'absorption de la lumière (coefficient d'extinction), il donne une indication de la luminosité d'un fluorophore.
Les paires FRET sont constituées de deux fluorophores
Le FRET (ou transfert d'énergie par résonance de Förster) désigne le transfert d'énergie d'un fluorophore donneur à un fluorophore accepteur. Ce transfert se produit lorsque l'accepteur est excité par la lumière d'émission provenant du donneur, et n'a lieu que si les deux fluorophores sont à proximité. Le FRET est souvent utilisé pour les études de liaison moléculaire ou dans les biocapteurs. Ces derniers changent de conformation lorsque l'analyte se lie et rapproche les deux fluorophores. Pour qu'il y ait FRET, la paire de fluorophores doit présenter un chevauchement entre le spectre d'émission du donneur et le spectre d'excitation de l'accepteur.3
Détection de l'intensité de la fluorescence
Même si les fluorophores diffèrent les uns des autres, la méthode de mesure de l'intensité de la fluorescence dans les microplaques est la même (voir la figure 4) :
- Une source lumineuse produit une lumière à large bande
- La gamme de longueurs d'onde d'excitation est filtrée à partir de la lumière à large bande.
- La gamme de longueurs d'onde d'excitation excite le fluorophore.
- La gamme de longueurs d'onde d'émission est filtrée à partir de la lumière d'émission.
- Un détecteur quantifie la lumière d'émission filtrée.
Contrairement à l'absorbance, la fluorescence n'est pas une mesure absolue. L'intensité du signal fluorescent est généralement relative à d'autres mesures ou à une mesure de référence effectuée par un instrument. Par conséquent, les lecteurs de plaques de fluorescence mesurent le signal lumineux émis par un échantillon en unités de fluorescence relatives (UFR).
Sources de lumière
Trois types de sources lumineuses sont couramment utilisés dans les lecteurs de microplaques. Quelle que soit la source lumineuse dont votre lecteur est équipé, ses performances peuvent influencer les résultats des mesures. Pour en savoir plus, consultez la note explicative : « Comment le nombre de flashs influence-t-il les résultats des mesures ? »
Lampe flash au xénon
Les lampes flash au xénon émettent de la lumière dans une gamme de longueurs d'onde comprise entre 200 et 2 500 nm. Elles sont donc adaptées à l'excitation de toute molécule absorbant la lumière dans la gamme des ultraviolets jusqu'à celle des infrarouges. Elles présentent un signal de sortie élevé et ont une longue durée de vie. C'est pour cette raison qu'elles sont utilisées comme sources d'excitation de fluorescence dans les lecteurs de plaques BMG LABTECH.
Lampe halogène au tungstène
Les lampes halogènes émettent de la lumière à partir d'environ 360 nm et ne conviennent pas pour mesurer l'intensité de la fluorescence UV. Comparées aux lampes au xénon, les lampes au tungstène ont une durée de vie plus courte, une intensité de sortie plus faible et une sensibilité moindre lorsqu'elles sont utilisées pour détecter la fluorescence dans les lecteurs de microplaques.
Les diodes électroluminescentes
Les diodes électroluminescentes (DEL) émettent une lumière de forte intensité, mais uniquement sur une largeur de bande spécifique. Par conséquent, plusieurs diodes sont nécessaires pour exciter des fluorophores à différentes longueurs d'onde, ce qui rend la détection flexible de plusieurs fluorophores plus compliquée et plus coûteuse.
Sélection de la longueur d'onde
Les sources d'excitation à large bande peuvent couvrir une large gamme de longueurs d'onde, de l'ultraviolet à l'infrarouge. Afin d'exciter spécifiquement le fluorophore concerné et d'éviter les signaux non spécifiques, il faut sélectionner (filtrer) la lumière d'excitation à large bande pour ne transmettre que la lumière autour du maximum d'excitation du fluorophore. De même, la lumière d'émission est filtrée pour correspondre au maximum d'émission du fluorophore. De cette manière, seule la fluorescence provenant du fluorophore d'intérêt est dirigée vers le détecteur. La sensibilité de l'essai est ainsi améliorée en optimisant la gamme de longueurs d'onde.
La sensibilité de la détection dans certains lecteurs de microplaques à intensité de fluorescence est améliorée par l'utilisation d'un miroir dichroïque, qui permet une sélection supplémentaire entre l'excitation et l'émission. Ce miroir transmet généralement la lumière supérieure à une longueur d'onde spécifique, mais bloque la lumière à des longueurs d'onde inférieures. La coupure se situe entre l'excitation et l'émission, ce qui réduit la fuite de la lumière d'excitation vers le détecteur.
Filtres
Les filtres optiques sont des lamelles de verre minces, rondes ou rectangulaires, recouvertes d'un revêtement optique. Le revêtement ne laisse passer que la lumière d'une certaine longueur d'onde. Les fluorophores ayant des maxima d'excitation et d'émission différents nécessitent des filtres différents. Un filtre est généralement nommé d'après la longueur d'onde de transmission moyenne, qui correspond souvent au maximum d'excitation ou d'émission du fluorophore. En outre, la largeur de bande d'un filtre optique indique l'étendue de la plage de transmission. Par exemple, un filtre de 485 nm avec une largeur de bande de 10 nm filtre la lumière blanche entre 480 et 490 nm.
Monochromateurs
Contrairement aux filtres optiques, ils sont capables de sélectionner la lumière de différentes longueurs d'onde en fonction des besoins. Deux types de monochromateurs sont utilisés dans les lecteurs de microplaques : les monochromateurs conventionnels à réseau et les monochromateurs à filtre variable linéaire. Dans les monochromateurs à réseau, les longueurs d'onde sont sélectionnées par diffraction de la lumière blanche en ses couleurs. Les longueurs d'onde sont ensuite sélectionnées par une fente qui bloque physiquement la lumière indésirable et ne laisse passer que la lumière souhaitée. L'inconvénient de cette méthode est la faible transmission de la lumière et l'apparition de lumière parasite, qui peut atteindre le détecteur et réduire la sensibilité globale de la fluorescence.
Le monochromateur à filtre variable linéaire (LVF) résout le problème de la lumière parasite, car il ne décompose pas la lumière, mais la filtre littéralement. Le monochromateur LVF utilise deux lames recouvertes d'un revêtement dégradé. Il est possible de sélectionner n'importe quelle longueur d'onde avec n'importe quelle largeur de bande en faisant glisser les deux filtres l'un contre l'autre. Le monochromateur LVF offre une transmission similaire à celle d'un filtre, élimine la lumière parasite et offre donc de meilleures performances que les monochromateurs à diffraction (voir la figure 6). L'utilisation de filtres linéaires variables dans les lecteurs de microplaques est une technologie brevetée par BMG LABTECH.
Détecteur
L'intensité de la fluorescence dans les lecteurs de microplaques est détectée par des tubes photomultiplicateurs (PMT). Ces derniers multiplient le signal par l'effet photoélectrique et convertissent la lumière en un signal électrique. Pour mesurer l'intensité de la fluorescence, deux PMT différents sont utilisés, qui se distinguent par leur gamme de longueurs d'onde sensibles. Le PMT bleu/vert à faible bruit est sensible dans la plage allant jusqu'à 740 nm et est souvent utilisé pour les mesures de luminescence. Le PMT à décalage vers le rouge permet de mesurer la fluorescence jusqu'à 900 nm, ce qui couvre également les colorants rouges et infrarouges. Ils sont souvent utilisés pour les mesures cellulaires car l'autofluorescence est réduite dans cette gamme de longueurs d'onde.
Comment effectuer une mesure de fluorescence sur un lecteur de plaques ?
Microplaque
Pour quantifier l'intensité de la fluorescence, il est nécessaire d'utiliser une plaque noire, car celle-ci réduit le bruit de fond et la réflexion de la lumière d'excitation. Vous trouverez plus de détails sur le choix de la plaque dans notre article de blog « La microplaque : l'utilité en pratique ».
Réglages du filtre et du monochromateur
Le choix du bon filtre est essentiel pour une détermination précise de l'intensité de la fluorescence. Comme nous l'avons déjà mentionné, les longueurs d'onde moyennes doivent être égales ou proches des maximums d'excitation et d'émission. Cependant, il y a quelques points à garder à l'esprit :
a) Distance entre les filtres
Si les bords des filtres d'excitation et d'émission sont trop proches l'un de l'autre, la lumière d'excitation peut s'échapper et atteindre le détecteur. Le signal du fluorophore disparaît alors dans la lumière d'excitation et devient inmesurable. La proximité des filtres dépend de leur qualité et de l'utilisation d'un miroir dichroïque. En règle générale, il faut séparer de 30 nm la longueur d'onde d'excitation transmise la plus élevée et la longueur d'onde d'émission transmise la plus basse (voir la figure 7).
b) Largeur de bande
La bande passante des filtres varie de quelques nanomètres à 100 nm. La largeur de bande influence la quantité de lumière pouvant traverser le filtre. Les filtres à faible largeur de bande (environ 10 nm) sont recommandés pour les fluorophores brillants ou pour les échantillons complexes présentant une autofluorescence élevée. C'est le cas, par exemple, des fluorophores verts tels que l'Alexa Fluor 488, le FITC ou la GFP dans un environnement cellulaire.
Les filtres à bande passante plus large sont recommandés pour les fluorophores à faible émission s'ils émettent dans une gamme où l'autofluorescence est faible (inférieure à 600 nm) ou si le tampon ne contient pas d'autre composé fluorescent. BMG LABTECH sélectionne les filtres en fonction des spectres d'excitation et d'émission du fluorophore. De plus, les paires de filtres sont mesurées et appariées afin que vous puissiez être sûr de recevoir les meilleurs filtres possibles. Les paramètres par défaut pour les fluorophores les plus courants sont déjà enregistrés dans le monochromateur, ce qui évite au chercheur d'avoir à effectuer cette sélection.
c) Les mesures FRET nécessitent deux canaux d'émission
Les considérations ci-dessus s'appliquent également aux mesures FRET. Toutefois, il convient de noter que deux émissions doivent être enregistrées séparément. Le fluorophore donneur excité émet de la lumière à une longueur d'onde spécifique s'il n'y a pas d'accepteur à proximité. Si un fluorophore accepteur est proche, le donneur transfère l'énergie à l'accepteur, qui émet alors de la lumière à une longueur d'onde plus élevée. Deux filtres d'émission sont donc nécessaires : l'un ne laissant passer que l'émission du donneur et l'autre que l'émission de l'accepteur.
Gain
Le gain de fluorescence est un facteur d'amplification, ou plus précisément la tension du détecteur à laquelle le signal lumineux entrant est amplifié. La modification du gain déplace la plage de détection le long de la courbe de concentration de l'analyte/essai. La largeur de cette plage reste toutefois fixe.
Les signaux faibles nécessitent une amplification importante (gain élevé), tandis que les signaux brillants nécessitent une amplification moindre (gain faible). Un gain mal choisi peut rendre les données mesurées inutilisables, car elles peuvent dépasser la plage de mesure ou les différences peuvent ne plus être résolues. Des données illustrant ces effets sont disponibles dans la note d'instructions intitulée Comment optimiser le réglage du gain de votre lecteur de microplaques ? Le gain est généralement réglé de manière à obtenir une sortie de mesure maximale pour l'échantillon dont l'intensité est la plus élevée attendue. Cela permet d'obtenir la plus grande fenêtre dynamique possible entre les valeurs de mesure les plus élevées et les plus basses (voir la figure 8).
Tous les lecteurs de microplaques BMG LABTECH déterminent le gain automatiquement, à condition qu'un puits spécifique avec une intensité de signal spécifique soit identifié. Sur les lecteurs CLARIOstarPlus et VANTAstar, aucun réglage de gain n'est nécessaire. La technologie Enhanced Dynamic Range (EDR) a été spécialement conçue pour offrir la plus grande plage dynamique possible, soit 8 décades de concentration. Les chercheurs bénéficient ainsi d'une commodité sans précédent pour les mesures en microplaques, puisqu'ils peuvent obtenir des résultats très fiables sur une large plage dynamique sans intervention manuelle.
Hauteur focale
La hauteur à laquelle un signal est détecté a un impact significatif sur la sensibilité de la mesure. Une mesure à une hauteur focale non optimale peut réduire le signal de 90 %. Par exemple, les cellules fluorescentes adhérentes doivent être mesurées près du fond de la plaque, tandis qu'une solution fluorescente homogène donne le signal le plus élevé juste sous la surface du liquide, et ce signal dépend du volume de remplissage du puits. Certains lecteurs de plaques déterminent automatiquement la hauteur focale optimale dans un puits sélectionné. Le CLARIOstar® Plus et le VANTAstar® vont encore plus loin et déterminent automatiquement la hauteur focale lors de la lecture d'une plaque.
Essais de fluorescence - À quoi sert l'intensité de la fluorescence ?
Le nombre de tests de fluorescence est aussi important que le nombre de questions biologiques et chimiques auxquelles ils peuvent répondre. C'est pourquoi les applications les plus courantes basées sur l'intensité de fluorescence sont décrites ci-dessous.
Tests de viabilité cellulaire et de cytotoxicité
Les tests fluorescents de viabilité et de cytotoxicité, ainsi que les lecteurs de microplaques, permettent de déterminer si les cellules sont endommagées par un composé ou si les cellules cancéreuses meurent après un traitement. Dans le test alamarBlue™, la résazurine est réduite par les cellules métaboliquement actives en un fluorophore qui témoigne de la viabilité cellulaire. L'incorporation de nucléosides marqués par fluorescence dans l'ADN est un autre moyen d'évaluer la viabilité cellulaire. Ces derniers sont incorporés et ne deviennent fluorescents que si la réplication de l'ADN a lieu, ce qui constitue un marqueur de viabilité.
Une méthode de détection de la mort cellulaire basée sur l'intensité de la fluorescence utilise des colorants fluorescents de l'ADN, comme le SYBR® Green ou le Celltox™ Green. Ces colorants ne pénètrent pas dans les cellules, mais entrent en contact avec l'ADN en solution lorsque la membrane cellulaire se rompt lors de la mort cellulaire, ce qui provoque alors une émission de fluorescence (voir la figure 9). Ces tests sont compatibles avec les mesures en temps réel et permettent de surveiller l'état de santé des cellules au fil du temps. Comme ces mesures sont effectuées sur plusieurs jours, la chambre à microplaques doit être incubée à 37 °C et à 5 % de CO₂ pour que les cellules restent en vie. Le CLARIOstar Plus avec unité de contrôle atmosphérique s'est avéré être l'environnement idéal pour les expériences cellulaires à long terme. D'autres tests de santé cellulaire sont décrits dans notre article de blog "Tests de viabilité cellulaire - Mesurez le degré de satisfaction de vos cellules".
Tests d'activité enzymatique
Les enzymes étant impliquées dans de nombreux processus biologiques, il est important d'étudier l'influence des inhibiteurs et des promoteurs sur les activités enzymatiques. Les principes de ces tests sont comparables : ils utilisent un substrat pré-fluorescent qui libère un fluorophore lors de la transformation enzymatique. Les fluorophores les plus courants sont basés sur des dérivés de la coumarine, comme dans le dosage par fluorescence de l'enzyme épigénétique histone désacétylase 1 (HDAC1), où ils peuvent être utilisés pour étudier l'inhibition des histones désacétylases.
Le 4-méthylumbelliférone est un autre fluorophore utilisé dans les essais enzymatiques. Un exemple est présenté dans la note d'application "CLARIOstar détermine l'activité d'une alpha-glucosidase acide humaine (GAA) produite par une mousse dans un essai basé sur la fluorescence". Le lecteur de microplaques multimode CLARIOstarPlus facilite l'analyse de l'activité enzymatique fluorescente. La technologie Enhanced Dynamic Range permet de lire sur une plage dynamique de 8 décades. L'augmentation du signal dans les essais d'activité enzymatique peut ainsi être facilement enregistrée, sans risque de choisir un gain incorrect ou d'optimiser l'instrument de manière fastidieuse. L'instrument est livré avec un logiciel d'analyse gratuit doté d'une fonction d'analyse cinétique enzymatique intégrée, couvrant les modèles de Michaelis-Menten et de Lineweaver-Burk (mesures cinétiques enzymatiques effectuées sur un lecteur de microplaques BMG LABTECH).
Changements de conformation : pliage et dépliage des protéines
La fluorescence d'acides aminés naturels, comme le tryptophane, peut également servir à mesurer les changements de conformation et l'activité enzymatique des protéines. Quelques exemples d'applications sont décrits dans notre article de blog intitulé " Tryptophan fluorescence : nature's probe" (La fluorescence du tryptophane : la sonde de la nature). La fluorescence du tryptophane est notamment utile pour tester de nouvelles thérapies destinées à des cibles médicamenteuses telles que les récepteurs couplés aux protéines G, qui sont l'une des cibles les plus populaires pour les médicaments actuellement sur le marché.
Essais d'agrégation des protéines
Les protéines s'agrègent lorsqu'elles sont mal repliées, ce qui est lié à des maladies telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie à prions. L'analyse de la formation d'agrégats moléculaires permet de diagnostiquer et de comprendre ces maladies, mais aussi de tester des médicaments potentiels. Les deux fluorophores, le bis-ANS et la thioflavine T (ThT), augmentent leur intensité de fluorescence lors de l'interaction avec les agrégats de protéines. Le bis-ANS interagit de préférence avec les agrégats amorphes, comme décrit dans la note d'application "Use of a BMG LABTECH microplate reader to monitor amyloid formation" (Utilisation d'un lecteur de microplaques BMG LABTECH pour surveiller la formation d'amyloïdes).
La ThT se lie aux fibrilles et est principalement utilisée dans les essais cinétiques. Si l'échantillon contient des molécules induisant l'agrégation, les protéines recombinantes s'agrègent et l'intensité de la fluorescence augmente (voir la figure 10).
La note d'application "Real-time quaking-induced conversion assay for prion seeding" explique comment ce test est utilisé pour détecter la maladie du prion, ou tremblante, dans des homogénats de cerveau de hamster. Comme ces tests d'agrégation nécessitent une agitation de longue durée, les lecteurs de microplaques de BMG LABTECH sont équipés de systèmes de transport très robustes et durables.
