CLARIOstar Plus
Most flexible Plate Reader for Assay Development
Qu'est-ce que l'intensité de la fluorescence ?
La fluorescence est basée sur la photoluminescence, un processus de lueur et d'émission de lumière. Il s'agit d'un processus physique dans lequel la lumière est émise après avoir été absorbée par une substance. L'intensité de la fluorescence indique la quantité de lumière (photons) émise. Elle correspond à l'étendue de l'émission et dépend de la concentration du fluorophore excité.
La fluorescence résulte de l'absorption d'énergie (lumière) par des molécules fluorescentes, appelées fluorophores. L'énergie absorbée élève les électrons à un niveau d'énergie supérieur. Cet état excité étant instable, les électrons retombent à l'état fondamental et émettent ainsi de la lumière (fig. 1).
Une plus petite partie des photons absorbés est convertie en mouvement et en chaleur. Ainsi, l'énergie libérée lorsque les électrons retombent est toujours inférieure à l'énergie nécessaire pour exciter l'électron. Étant donné que les rayonnements à ondes élevées sont moins énergétiques que les rayonnements à ondes courtes, l'émission a toujours une longueur d'onde supérieure à celle de la lumière qui a été utilisée pour l'excitation. La distance entre les maxima (pics) d'excitation et d'émission est appelée décalage de Stokes (fig. 2).1
La caractéristique de la lumière d'excitation (absorption) d'être à une longueur d'onde inférieure à celle de la lumière d'émission ouvre la possibilité d'utiliser l'intensité de la fluorescence à des fins analytiques. Les fluorophores peuvent être détectés en les excitant à une longueur d'onde spécifique et en mesurant l'intensité de leur émission à une longueur d'onde plus élevée. L'intensité de la fluorescence est linéairement corrélée à la concentration du fluorophore excité et convient donc aux analyses quantitatives.
L'intensité de fluorescence est largement utilisée dans les applications des sciences de la vie : en microscopie pour localiser et quantifier les biomolécules, en cytométrie de flux pour analyser les cellules et dans les essais en microplaques pour quantifier les molécules, les activités enzymatiques et même l'interaction entre les molécules. Cette page se concentre sur l'utilisation de l'intensité de la fluorescence dans les essais en microplaques, sur la manière dont elle est détectée, sur les éléments à prendre en compte pour les mesures de l'intensité de la fluorescence et sur les essais les plus couramment utilisés.
Fluorophores
Un fluorophore (ou fluorochrome) est un composé fluorescent qui peut émettre de la lumière lorsqu'il est excité par la lumière. On connaît des milliers de molécules qui présentent des caractéristiquesfluorescentes2:
Leur taille moléculaire
De nombreux fluorophores sont des composés chimiques de petite taille qui peuvent être facilement liés à d'autres molécules. Les protéines fluorescentes telles que les protéines fluorescentes vertes ou rouges (GFP ou RFP) sont plus grandes et peuvent être exprimées par les cellules. Elles sont utilisées pour marquer des protéines dans le cadre d'études d'expression, pour des biocapteurs exprimés de manière endogène ou simplement comme marqueurs de quantification cellulaire. Lisez ici comment l'efficacité de la transfection baséesur la GFP et le mcherry peut être contrôlée avec précision avec le VANTAstar.
Longueurs d'onde d'excitation et d'émission
Les caractéristiques d'excitation et d'émission de lumière d'un fluorophore sont affichées sous forme de spectres : dans un système de coordonnées, les nanomètres sont indiqués sur l'axe des x et l'intensité sur l'axe des y. Les courbes sont normalisées à 100 % et permettent d'identifier rapidement les longueurs d'onde maximales d'excitation et d'émission ainsi que le décalage de Stokes. Ces informations sont importantes pour choisir le bon fluorophore pour un essai. Il doit être compatible avec le système de détection, l'autofluorescence potentielle et les autres fluorophores si plusieurs sont utilisés dans une expérience.
Rendement quantique
Le rendement quantique est une mesure de l'efficacité avec laquelle une molécule excitée convertit les photons absorbés en lumière d'émission. En combinaison avec la mesure dans laquelle la lumière est absorbée (coefficient d'extinction), le rendement quantique donne une indication de la luminosité d'un fluorophore.
Les paires FRET sont constituées de deux fluorophores
Le FRET (transfert d'énergie par résonance de Förster) décrit le transfert d'énergie d'un fluorophore donneur à un fluorophore accepteur. Le transfert se produit lorsque l'accepteur est excité par la lumière d'émission provenant du donneur et n'a lieu que si les deux fluorophores sont à proximité. La FRET est souvent utilisée pour les études de liaison moléculaire ou dans lesbiocapteurs. Ces derniers changent de conformation lorsque l'analyte se lie et rapproche les deux fluorophores. Pour qu'il y ait FRET, la paire de fluorophores doit présenter un chevauchement entre le spectre d'émission du donneur et le spectre d'excitation de l'accepteur.3
Détection de l'intensité de la fluorescence
Même si les fluorophores diffèrent les uns des autres, la base des mesures de l'intensité de la fluorescence dans les microplaques est la même (fig. 4) :
- Une source lumineuse produit une lumière à large bande
- La gamme de longueurs d'onde d'excitation est filtrée à partir de la lumière à large bande.
- La gamme de longueurs d'onde d'excitation excite le fluorophore.
- La gamme de longueurs d'onde d'émission est filtrée à partir de la lumière d'émission.
- Un détecteur quantifie la lumière d'émission filtrée.
Contrairement à l'absorbance, la fluorescence n'est pas une mesure absolue. L'intensité du signal fluorescent est généralement relative à d'autres mesures ou à une mesure de référence prise par un instrument. Par conséquent, leslecteurs de plaques de fluorescence mesurent le signal lumineux émis par un échantillon en unités de fluorescence relatives (UFR).
Sources de lumière
Trois sources lumineuses sont couramment utilisées dans les lecteurs de microplaques. Quelle que soit la source lumineuse dont votre lecteur est équipé, ses performances peuvent affecter les résultats des mesures. Pour en savoir plus, consultez la note explicative : Comment le nombre de flashs influence-t-il les résultats des mesures ?
Lampe flash au xénon
Les lampes flash au xénon émettent dela lumière dans une gamme de 200 nm à 2500 nm. Elles sont donc adaptées à l'excitation de toute molécule qui absorbe la lumière dans la gamme des UV jusqu'à la gamme des infrarouges. Elles présentent un signal de sortie élevé et ont une longue durée de vie. En raison de ces avantages, les lampes flash au xénon sont utilisées comme sources d'excitation de fluorescence dans les lecteurs de plaques BMG LABTECH.
Lampe halogène au tungstène
Les lampes halogènes émettent de la lumière à partir d'environ 360 nm et ne sont pas adaptées à la mesure de l'intensité de la fluorescence UV. En comparaison avec les lampes au xénon, les lampes au tungstène ont une durée de vie plus courte, une intensité de sortie plus faible et une sensibilité plus faible lorsqu'elles sont utilisées pour la détection de la fluorescence dans les lecteurs de microplaques.
Les diodes électroluminescentes
Les diodes électroluminescentes (DEL) émettent une lumière de forte intensité, mais uniquement sur une largeur de bande spécifique. Par conséquent, plusieurs diodes sont nécessaires pour différentes longueurs d'onde d'excitation, ce qui rend la détection flexible de plusieurs fluorophores plus compliquée et plus coûteuse.
Sélection de la longueur d'onde
Les sources d'excitation à large bande peuvent couvrir une large gamme de longueurs d'onde allant de l'UV à l'infrarouge. Afin d'exciter spécifiquement le fluorophore concerné et d'éviter les signaux non spécifiques, la lumière d'excitation à large bande doit être sélectionnée (filtrée) pour ne transmettre que la lumière autour du maximum d'excitation du fluorophore. De même, la lumière d'émission est filtrée pour le maximum d'émission du fluorophore. De cette manière, seule la fluorescence provenant du fluorophore d'intérêt est guidée vers le détecteur. En conséquence, la sensibilité de l'essai est améliorée en optimisant la gamme de longueurs d'onde.
La sensibilité de la détection dans certains lecteurs de microplaques à intensité de fluorescence est améliorée par l'utilisation d'une sélection supplémentaire entre l'excitation et l'émission : unmiroir dichroïque. Le miroir dichroïque transmet généralement la lumière supérieure à une longueur d'onde spécifique, mais bloque la lumière à des longueurs d'onde inférieures. La coupure se situe entre l'excitation et l'émission et réduit la fuite de la lumière d'excitation vers le détecteur.
Filtres
Lesfiltres optiques sont deslames de verre minces, rondes ou rectangulaires, recouvertes d'un revêtement optique. Le revêtement ne transmet que la lumière d'une certaine longueur d'onde. Les fluorophores ayant des maxima d'excitation et d'émission différents nécessitent des filtres différents. Un filtre est généralement nommé d'après la longueur d'onde de transmission moyenne, qui correspond souvent au maximum d'excitation ou d'émission du fluorophore. En outre, un filtre optique a une largeur de bande définie (ou passe-bande), qui indique l'étendue de la plage de transmission. Par exemple, un filtre de 485 nm avec une largeur de bande de 10 nm filtre la lumière blanche entre 480 et 490 nm.
Monochromateurs
Contrairement aux filtres optiques, les monochromateurs sont capables de sélectionner la lumière de différentes longueurs d'onde en fonction des besoins. Deux types de monochromateurs sont utilisés dans les lecteurs de microplaques : les monochromateurs conventionnels à réseau et les monochromateurs à filtre variable linéaire. Dans les monochromateurs à réseau, les longueurs d'onde sont sélectionnées par diffraction de la lumière blanche en ses couleurs. Les longueurs d'onde sont ensuite sélectionnées par une fente, qui bloque physiquement la lumière indésirable et ne transmet que la lumière désirée. L'inconvénient de la méthode des réseaux est la faible transmission de la lumière et l'apparition de lumière parasite, qui peut atteindre le détecteur et réduire la sensibilité globale de la fluorescence.
Lemonochromateur à filtre variable linéaire (LVF) résout leproblème de la lumière parasite, car il ne décompose pas la lumière, mais la filtre littéralement. Le monochromateur LVF utilise deux lames recouvertes d'un revêtement dégradé. Il est possible de sélectionner n'importe quelle longueur d'onde avec n'importe quelle largeur de bande en faisant glisser les deux filtres linéaires l'un contre l'autre. Le monochromateur LVF a une transmission semblable à celle d'un filtre, élimine la lumière parasite et offre donc de meilleures performances que les monochromateurs à diffraction (fig. 6). L'utilisation de filtres linéaires variables dans les lecteurs de microplaques est une technologie brevetée par BMG LABTECH.
Détecteur
L'intensité de la fluorescence dans les lecteurs de microplaques est détectée par des tubes photomultiplicateurs (PMT). Ils multiplient le signal par l'effet photoélectrique et convertissent la lumière en un signal électrique. Pour mesurer l'intensité de la fluorescence dans les lecteurs de microplaques, on utilise deux PMT différents, qui se distinguent par leur gamme de longueurs d'onde sensibles. Un PMT bleu/vert à faible bruit est sensible dans la plage allant jusqu'à 740 nm et est souvent utilisé pour les mesures de luminescence. Un PMT à décalage vers le rouge mesure la fluorescence de manière sensible jusqu'à 900 nm et couvre donc également les colorants rouges et infrarouges. Ils sont souvent utilisés pour les mesures cellulaires car l'autofluorescence est réduite dans cette gamme de longueurs d'onde.
Comment effectuer une mesure de fluorescence sur un lecteur de plaques ?
Microplaque
Les quantifications de l'intensité de la fluorescence nécessitent une plaque noire car elle réduit le bruit de fond et la réflexion de la lumière d'excitation. Vous trouverez plus de détails sur le choix de la plaque dans notre article de blog"La microplaque : l'utilité en pratique".
Réglages du filtre et du monochromateur
Le choix du bon filtre est essentiel pour une détermination précise de l'intensité de la fluorescence. Comme nous l'avons déjà mentionné, les longueurs d'onde moyennes doivent être égales ou proches du maximum d'excitation et d'émission. Cependant, il y a quelques points à garder à l'esprit :
a) Distance entre les filtres
Si les bords des filtres d'excitation et d'émission sont trop proches l'un de l'autre, la lumière d'excitation peut s'échapper et atteindre le détecteur. Le signal du fluorophore disparaît alors dans la lumière d'excitation et n'est plus mesurable. La proximité des filtres dépend de la qualité des filtres et de l'utilisation d'un miroir dichroïque. En règle générale, la longueur d'onde d'excitation transmise la plus élevée et la longueur d'onde d'émission transmise la plus basse doivent être séparées de 30 nm (fig. 7).
b) Largeur de bande
La bande passante des filtres varie de quelques nanomètres à 100 nm. La bande passante affecte la quantité de lumière qui peut passer le filtre. Les filtres à faible largeur de bande (~10 nm) sont recommandés pour les fluorophores brillants ou pour les échantillons complexes présentant une autofluorescence élevée. Un exemple typique est celui des fluorophores verts tels que AlexaFluor488, FITC ou GFP dans un environnement cellulaire.
Les filtres à bande passante plus large sont recommandés pour les fluorophores à faible émission s'ils émettent dans une gamme où l'autofluorescence est faible (émission <600nm) ou si le tampon ne contient pas d'autre composé fluorescent. BMG LABTECH sélectionne les filtres sur la base des spectres d'excitation et d'émission du fluorophore. De plus, les paires de filtres sont mesurées et appariées l'une à l'autre afin que vous puissiez être sûr de recevoir les meilleurs filtres possibles. Les paramètres par défaut pour les fluorophores courants sont également déjà enregistrés pour le monochromateur, de sorte que ce travail de sélection n'est pas laissé à la charge du chercheur.
c) Les mesures FRET nécessitent deux canaux d'émission
Les considérations ci-dessus s'appliquent également aux mesures FRET. Toutefois, il convient de noter que deux émissions doivent être enregistrées séparément. Le fluorophore donneur excité émet de la lumière à une longueur d'onde spécifique s'il n'y a pas d'accepteur à proximité. Si un fluorophore accepteur est proche, le donneur transfère l'énergie à l'accepteur qui émet alors de la lumière à une longueur d'onde plus élevée. Cela signifie que deux filtres d'émission sont nécessaires, l'un ne laissant passer que l'émission du donneur et l'autre que l'émission de l'accepteur.
Gain
Legain de fluorescence estun facteur d'amplification ou, plus précisément, la tension du détecteur à laquelle le signal lumineux entrant est amplifié. La modification du gain déplace la plage dynamique de détection le long de la courbe de concentration de l'analyte/essai. Cependant, la largeur de la plage dynamique est fixe et ne change pas.
Les signaux faibles nécessitent une amplification importante (gain élevé) et les signaux brillants une amplification moindre (gain faible). Un gain mal choisi peut rendre les données mesurées inutilisables parce qu'elles dépassent la plage de mesure ou que les différences ne sont plus résolues. Des données mettant en évidence ces effets sont disponibles dans la note d'instructions : Comment optimiser le réglage du gain de votre lecteur de microplaques ? Le gain est généralement réglé de manière à obtenir une sortie de mesure maximale sur l'échantillon dont l'intensité est la plus élevée attendue. Cela permet d'avoir la plus grande fenêtre dynamique possible entre les valeurs de mesure les plus élevées et les plus basses (fig. 8).
Tous les lecteurs de microplaques BMG LABTECH déterminent le gain automatiquement, à condition qu'un puits spécifique avec une intensité de signal spécifique soit identifié. Sur les lecteursCLARIOstarPlus etVANTAstar, aucunréglage de gain n'est nécessaire. La technologie EnhancedDynamic Range (EDR) a été spécialement conçue pour offrir la plus grande plage dynamique possible - 8 décades de concentration. Les chercheurs bénéficient ainsi d'une commodité sans précédent dans les mesures en microplaques, puisque des résultats très fiables peuvent être mesurés sur une large plage dynamique sans intervention manuelle.
Hauteur focale
La hauteur à laquelle un signal est détecté a un impact significatif sur la sensibilité de la mesure. La mesure à une hauteur focale non optimale peut réduire le signal jusqu'à 90 %. Par exemple, les cellules fluorescentes adhérentes doivent être mesurées près du fond de la plaque, alors qu'une solution fluorescente homogène donne le signal le plus élevé juste sous la surface du liquide et dépend du volume de remplissage du puits. Certains lecteurs de plaques déterminent la hauteur focale optimale dans un puits sélectionné. Le CLARIOstar® Pluset le VANTAstar® vontencore plus loin et déterminent automatiquement la hauteur focale lors de la lecture d'une plaque.
Essais de fluorescence - À quoi sert l'intensité de la fluorescence ?
Le nombre de tests de fluorescence est aussi important que le nombre de questions biologiques et chimiques auxquelles ils peuvent répondre. C'est pourquoi les applications les plus courantes basées sur l'intensité de fluorescence sont décrites ci-dessous.
Tests de viabilité cellulaire et de cytotoxicité
Les tests de viabilité et de cytotoxicité fluorescents et les lecteurs de microplaques permettent de déterminer si les cellules sont endommagées par un composé ou si les cellules cancéreuses meurent après le traitement. Dans letest alamarBlue™, la résazurine est réduite par les cellules métaboliquement actives en un fluorophore et rend compte de la viabilité cellulaire. L'incorporation dans l'ADN de nucléosides marqués par fluorescence est un autre moyen d'évaluer la viabilité cellulaire. Ceux-ci sont incorporés et ne deviennent fluorescents que si la réplication de l'ADN a lieu, ce qui constitue un marqueur de viabilité.
Une façon de détecter la mort cellulaire par l'intensité de la fluorescence est basée sur des colorants fluorescents de l'ADN tels que le SYBR® Greenou le Celltox™ Green. Ces colorants ne sont pas perméables aux cellules, mais ils sont exposés à l'ADN en solution lorsque la membrane cellulaire est rompue pendant la mort cellulaire et commencent alors à émettre une fluorescence (fig. 9). Ces tests sont compatibles avec les mesures en temps réel et permettent de surveiller la santé des cellules au fil du temps. Comme ces mesures sont effectuées sur plusieurs jours, la chambre à microplaques doit être incubée à 37 °C et à 5 % deCO2 pourque les cellules soient satisfaites. Le CLARIOstar Plus avecunité de contrôle atmosphérique s'estavéré être l'atmosphère idéale pour les expériences cellulaires à long terme. D'autres tests de santé cellulaire sont décrits dans notre article de blog "Tests de viabilité cellulaire - Mesurez le degré de satisfaction de vos cellules".
Tests d'activité enzymatique
Les enzymes étant impliquées dans de nombreux processus biologiques, il est important d'étudier comment les inhibiteurs ou les promoteurs influencent les activités enzymatiques. Les principes des tests enzymatiques sont comparables : ils utilisent un substrat pré-fluorescent qui, lors de la transformation enzymatique, libère un fluorophore. Les fluorophores courants sont basés sur des dérivés de la coumarine, comme dans ledosage par fluorescence de l'enzyme épigénétique histone désacétylase 1 (HDAC1), où ils peuvent être utilisés pour étudier l'inhibition des histones désacétylases.
Le 4-méthylumbelliférone est un autre fluorophore utilisé dans les essais enzymatiques. Un exemple se trouve dans la note d'application "CLARIOstar détermine l'activité d'une alpha-glucosidase acide humaine (GAA) produite par une mousse dans un essai basé sur la fluorescence". Lelecteur de microplaquesmultimode CLARIOstarPlus facilite l'analyse de l'activité enzymatique fluorescente. La technologie Enhanced Dynamic Range permet de lire sur une plage dynamique de 8 décades. Ainsi, l'augmentation du signal dans les essais d'activité enzymatique est facilement enregistrée sans risque de choix d'un gain incorrect ou d'une optimisation fastidieuse de l'instrument. L'instrument est livré avec un logiciel d'analyse gratuit avec analyse cinétique enzymatique intégrée couvrant les modèles de Michaelis-Menten et Lineweaver-Burk(mesures cinétiques enzymatiques effectuées sur un lecteur de microplaques BMG LABTECH).
Changements de conformation : pliage et dépliage des protéines
La fluorescence d'acides aminés naturels comme le tryptophane peut également être utilisée pour mesurer les changements de conformation et l'activité enzymatique des protéines. Quelques exemples d'applications sont décrits dans notre article de blog intitulé " Tryptophan fluorescence : nature's probe" (La fluorescence du tryptophane : la sonde de la nature). La fluorescence du tryptophane est utile, par exemple, pour cribler de nouvelles thérapies pour des cibles médicamenteuses telles que les récepteurs couplés aux protéines G, l'une des cibles les plus populaires pour les médicaments approuvés sur le marché aujourd'hui.
Essais d'agrégation des protéines
Les protéines s'agrègent lorsqu'elles sont mal repliées et l'agrégation est liée à des maladies telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie à prions. L'analyse de la formation d'agrégats moléculaires aide à diagnostiquer et à comprendre ces maladies, ainsi qu'à tester des médicaments potentiels. Les deux fluorophores bis-ANS et Thioflavine T (ThT) augmentent leur intensité de fluorescence lors de l'interaction avec les agrégats de protéines. Le Bis-ANS interagit de préférence avec les agrégats amorphes, comme décrit dans la note d'application "Use of a BMG LABTECH microplate reader to monitor amyloid formation" (Utilisation d'un lecteur de microplaques BMG LABTECH pour surveiller la formation d'amyloïdes).
Le ThT se lie aux fibrilles et est principalement utilisé dans les essais cinétiques. Si l'échantillon contient des molécules induisant l'agrégation, les protéines recombinantes s'agrègent et la fluorescence augmente (fig. 10).
La note d'application "Real-time quaking-induced conversion assay for prion seeding" explique comment ce test est utilisé pour détecter la maladie du prion, la tremblante, dans des homogénats de cerveau de hamster. Comme ces tests d'agrégation nécessitent une agitation de longue durée, les lecteurs de microplaques de BMG LABTECH peuvent être équipés de systèmes de transport très robustes et durables.
