네펠로메트리

네펠로메트리란 무엇인가요?

네펠로 측정법(그리스어 네펠로: 구름에서 유래)은 부유 불용성 입자의 존재로 인한 용액의 탁도 또는 혼탁도를 측정하는 데 사용되는 분석 화학 기법입니다.

부유 고체 입자가 포함된 탁한 용액을 통과하면 빛이 투과, 흡수(차단) 및 산란(입자에서 반사됨, 그림 1)됩니다. 산란되는 빛의 양은 용액에 포함된 불용성 입자의 크기, 모양 및 농도뿐만 아니라 입사되는 빛의 파장에 따라 달라집니다.

빛의 산란에 대한 이론과 개념은 19세기 말과 20세기 초에 레이리, 미에, 드뷔를 중심으로 처음 연구되었습니다.

네펠로메트리는 임상 화학 분야에서 면역 글로불린 및 거대 분자와 같은 혈액 내 혈청 단백질의 검출 및 정량화를 위한 면역 분석에 처음 적용되었습니다. 이러한 애플리케이션은 오늘날에도 여전히 사용되고 있습니다.마이크로플레이트 판독기에 적용하면 주로 약물 용해도 및 단백질 응집 또는 박테리아 성장과 같은 물질 침전(그림 2)을 분석하는 데 사용됩니다.

네펠로메트리와 탁도계의 차이점

탁도 또는 혼탁도는 네펠로메트리 또는 탁도계로 감지할 수 있습니다. 두 기술 모두 비파괴적이며 고체 입자의 현탁으로 인한 빛의 산란을 기반으로 합니다. 이 두 용어는 때때로 동의어로 사용되기도 하지만 엄밀히 말하면 그렇지 않습니다. 탁도 측정은 불용성 입자의 산란 효과로 인해 시료를 통해 투과되는 빛의 강도 손실을 측정하는 프로세스입니다.흡광도와 마찬가지로 탁도 측정은 시료를 통해 투과되는 빛의 강도, 특히 감쇠를 정량화합니다. 탁도 측정에서는 알려진 파장의 빛이 용액에 불용성 입자가 포함된 시료를 통과합니다. 광원과 일직선으로 배치된 검출기가 시료를 통과하는 빛을 수집합니다(그림 3A). 빛 투과율의 감소는 기준과 비교하여 측정되고 흡수된 빛은 광학 밀도(OD) 단위로 정량화됩니다.² 따라서예를 들어흡광도 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 탁도를 측정할 수 있습니다.

이와 대조적으로, 네펠로메트리는 시료의 불용성 입자에 의해 산란된 빛의 강도를 직접 정량화하여 용액의 탁도를 결정합니다. 일반적으로 산란광은 투과광의 간섭을 피하기 위해 입사광원에 대한 각도에서 측정됩니다(그림 3B). 이 점에서형광 강도 측정과 유사점을 공유합니다.

네펠로메트리와 탁도 측정법 비교

광 산란 분석을 실행할 때 네펠로메트리와 탁도 측정법 중 어떤 것을 선택할지는 주로 두 가지 요인에 의해 결정됩니다.

• 시료의 농도와광원의 강도에 대한 산란광의 결과 강도가 가장 관련성이 높은 요소입니다. 시료에 불용성 입자가 적은 경우(농도가 낮은 경우) 투과광의 강도는 광원의 강도와 거의 비슷합니다. 이 경우 네펠로메트리가 더 적절한 선택입니다. 분자 흡수에서와 마찬가지로 두 개의 강렬한 신호 사이의 작은 차이는 거의 확인할 수 없으므로 시료에 불용성 입자가 고농도로 포함되어 있어 빛 투과가 현저히 감소하는 경우 탁도계가 더 적합합니다.

• 산란 입자의 크기는 반사(차단) 또는 산란되는 빛의 양에 영향을 미치므로 고려해야 할 두 번째 파라미터입니다. 입자 크기가 입사광의 파장보다 클 때 반사가 발생합니다. 입자 크기가 입사 파장과 비슷하거나 작으면 산란이 일어납니다. 따라서 네펠로메트리는 산란이 반사보다 우세하므로 작은 입자를 감지하는 데 가장 적합하며, 0.1~1μm가 최적의 크기입니다. 탁도 측정에서는 빛 투과율의 상대적 감소가 감지되므로 입자 크기는 관련이 적습니다. 실제로 입자 크기가 커서 반사 또는 굴절이 증가하더라도 탁도 측정은 여전히 가능합니다.

따라서 네펠로메트리는 낮은 농도의 작은 부유 입자 분석에 가장 적합하며 더 높은 감도를 제공합니다. 탁도계는 일반적으로 고농도의 비교적 큰 불용성 입자에 적용됩니다. 예를 들어 생물학에서 용액 내 세포(예: 박테리아)의 수를 측정하는 데 일반적으로 사용됩니다. 3

네펠로메트리의 원리

액체에서의 빛 산란은입자 물리학의 탄성 산란 규칙을 따르며, "충돌" 동안 어느 입자에도 에너지가 흡수되지 않습니다. 산란 이벤트 전후의 광자의 에너지는 변하지 않습니다. 탄성 산란은 큰 입자와 작은 입자에서 다릅니다. 큰 입자의 경우 빛은 주로 정방향(정각)으로 산란됩니다. 입자의 크기가 부딪히는 빛 파장의 5%보다 작은 경우 산란은 대칭적으로 분산됩니다.⁴

용해성 분자는 일반적으로 (입사광의 파장에 비해) 크기가 작고 거의 대칭적인 방식으로 산란합니다(그림 4A). 이와 대조적으로 용액 내 침전물과 복합체는 일반적으로 크기가 더 크며(입사광의 파장에 더 가깝게) 주로 정각 산란을 생성합니다(그림 4B). 네펠로메트릭 검출은 일반적으로 전방 산란을 측정하는 데 중점을 둡니다.

산란과 입자의 농도

산란광의 강도(_IS)와 침전물의 농도(C)는 다음 공식에 의해 관련됩니다:

_IS=_kS*_I0* C

여기서 k_S는 시스템 보정을 통해 결정된 상수이고I₀은 광원에서의 강도입니다.

입자 현탁액의 물리적 특성은 다양한 변수에 의해 영향을 받습니다. 산란은 용액 내 고체 입자의 농도와 관련이 있지만 산란된 빛의 세기는 입자의 크기와 모양에 따라 달라집니다. 크기가 다른 침전물을 포함하는 동일하게 농축된 샘플은 서로 다른 산란 수준을 나타냅니다.

또한 침전물의 크기와 모양은 온도, pH, 시약 농도뿐만 아니라 혼합, 교반 순서, 침전물 형성과 검출 사이의 간격에 따라 영향을 받습니다. 시료와 분석 간에 재현 가능한 조건과 결과를 얻으려면 이러한 다양한 변수를 모두 고려해야 합니다^{.4, 5}

광원의 파장

파장 선택은 일반적으로 시료의 형광을 유도하지 않는 한 현탁액 입자에 의한 입사광의 흡수를 고려하지 않으므로 일반적으로 관련이 없습니다. 따라서 비형광 시료를 사용하는 경우 특별히 파장을 선택할 필요가 없습니다. 파장의 선택은 주로 잠재적인 간섭을 최소화해야 할 필요성에 기반하며, 입사광 또는 산란 자체의 강도에 영향을 미칩니다.⁴

네펠로메트리 계측: 어떻게 감지할 수 있나요?

네펠로미터를 네펠로메트릭 검출에 사용할 수 있지만, 산란의 각도 의존성 때문에 전용 기기의 개발이 필요하게 되었습니다. 입사 빔에 비스듬히 위치한 감지기가 있는 탁도계를 네펠로미터라고 하며, 낮은 탁도 값을 측정하는 표준 기기로 간주됩니다. 산란광의 강도를 측정합니다. 투과광은 감지되지 않습니다.

이 장치의 기본 구성 요소에는 광원, 광산란 광학 장치 및 검출기가 포함됩니다. 광원은 샘플을 통과하는 빔을 생성합니다. 할로겐 및 크세논 램프 또는 레이저를 광원으로 사용할 수 있습니다. 레이저는 감도, 고강도 및 일관된 특성(방출된 광자가 서로 "단계적으로" 일치)으로 인해 일반적으로 가장 일반적으로 선택됩니다. 들어오는 파장과 나가는 파장은 동일하므로 광학적으로 선택되지 않습니다.

감지기는 광원 반대편에 들어오는 광선에 대해 비스듬히 배치됩니다. 위치에 따라 전방 각 산란 또는 측면 산란의 변화를 감지합니다. 산란을 가장 많이 수집할 수 있는 각도에 따라 30°, 70° 또는 90°의 각도로 디텍터를 배치할 수 있습니다.

네펠로메트리는 엔드포인트 또는 동적 측정으로 수행할 수 있습니다. 엔드포인트 측정은 반응이 평형에 도달한 후 또는 미리 정해진 시점에 최대 빛 산란을 정량화합니다. 동적 감지(시간에 따른 다중 판독)는 전체 침전 과정에 걸쳐 적용할 수 있으며 일반적으로 반응에 대한 더 많은 정보를 제공합니다.

네펠로메트리의 적용

1970년대부터 면역 네펠로메트리는 면역 분석 분석을 위해 임상 실험실에서 적용되어 왔습니다. 원래는 면역 복합체(항원-항체)의 형성 및 침전을 감지하는 데 사용되었으며, 오늘날에도 여전히 사용되고 있습니다. 면역 혈청 측정법은 면역 글로불린을 포함한 혈청 단백질의 농도를 측정하는 데에도 사용되며, 대량 자동 응고 측정기에도 사용됩니다. 이러한 장치는 혈액 샘플의 응고 인자를 정량화하고 다중 분석 응고 프로파일을 생성할 수 있습니다.

제약 실험실에서 네펠로메트리는 주로 약물이나 화합물의 용해도를 평가하는 데 사용됩니다. 또한 미생물 성장의 정량화를 위한 유망한 방법이며 효모(예: S. 세레비지애)와 같은 미생물 현탁액의 세포 수를 측정하는 데 일반적으로 사용됩니다.⁶

마이크로플레이트 기반 네펠로메트리

네펠로메트리는 마이크로플레이트에서도 감지할 수 있습니다(그림 5). 이 형식은 시료와 화합물의 마이크로플레이트 기반 처리가 효율성과 처리량을 모두 증가시키기 때문에 생명과학 실험실과 제약 산업에 특히 유리합니다.마이크로플레이트 기반 네펠로미터는 일반적으로탁도 데이터 수집에 더 높은 처리량, 단순화 및 소량 접근 방식을 제공합니다.세계 최초의 마이크로 플레이트 기반 레이저 기반네펠로미터 검출 장치인NEPHELOstarPlus는 비엠지랩텍에서개발했습니다. 이 기기는 레이저 빔이 시료를 통과할 때 발생하는 전방 산란광을 측정하여 마이크로 플레이트의 용액 내 입자를 잘 감지합니다.

광원으로 사용되는 고조준 레이저 다이오드는 강도와 빔 직경을 조절할 수 있습니다. 이러한 기능은 메니스커스 문제를 줄이고 감도를 최적화하여 384개의 웰 플레이트 형식으로 측정할 수 있습니다.

네펠로스타플러스에서 레이저 빔은 시료 웰을 통과하여 마이크로 플레이트 아래에 위치한 울브리히트 구(적분 구)로 전달됩니다. 이 구는 내부 표면의 모든 지점에 입사되는 산란광을 수집하고 다중 반사를 통해 다른 모든 지점에 균등하게 분산시킵니다. 울브리히트 구체는 최대 80° 각도의 산란광을 수집하고 강도는 유지하지만 원래의 산란 각도를 최소화하여 공간 정보를 제거하고 검출기로 정량화할 수 있는 확산광을 생성합니다(그림 6).

광선이 우물 안의 침전물에 의해 굴절되지 않으면 울브리히트 구를 똑바로 통과하고 반사가 발생하지 않으므로 신호가 검출기에 도달하지 않습니다. 시료에 입자가 존재하면 빛이 산란되고 울브리히트 구 내부에서 반사되어 입사광에 대해 90° 각도로 배치된 검출기에서 최종적으로 측정됩니다(그림 7).

탁도는 특히 수질 테스트에서 NTU(네펠로메트릭 탁도 단위)로 표시되는 경우가 많습니다. NTU 값은 기준 포마진 현탁액과의 비교 측정을 기반으로 보정된 기기에서 도출할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 많은 양의 시료를 사용하는 다단계 프로세스로 시간이 많이 소요됩니다. 네펠로스타 플러스는 결과를 상대 네펠로메트릭 단위(RNU)로 정량화합니다. NTU를 RNU와 비교하는 방법은 애플리케이션 노트 "NEPHELOstar Plus를 사용한 네펠로메트릭 탁도 단위(NTU) 평가를 위한 처리량 향상"에 설명되어 있습니다. 두 접근법 간의 상관관계는 그림 8에 나와 있습니다.

마이크로플레이트의 품질

일반적으로 네펠로메트릭 분석은 96개 또는 384개의 웰 마이크로플레이트에서 수행됩니다. 마이크로플레이트의 광학 품질은 매우 중요한 측면입니다. 웰 바닥의 먼지, 오물, 지문 또는 긁힘과 같은 결함은 빛을 산란시켜 위양성 신호를 생성하고 분석 창을 줄이거나 감도를 크게 떨어뜨릴 수 있습니다. 따라서 값이 특히 높거나 블랭크의 평균에 표준 편차 2개를 더한 값보다 높은 웰은 일반적으로 고려하지 않아야 합니다.⁷

마이크로플레이트 기반 네펠로메트리의 응용 분야

마이크로플레이트 기반 네펠로메트리는 높은 처리량의 화합물 용해도 스크리닝에 적용할 수 있기 때문에 제약 산업에 매우 유용한 도구입니다. 또한 미생물 성장 및 단백질 결합 동역학, 체액의 석회화 성향, 혈청의 류마티스 인자, 항원-항체 결합(그림 9) 등을 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다.

약물 용해도 분석

제약 산업에서고처리량 스크리닝은신약 발견을 위한 중요한 방법입니다. 이 과정에서 용해도 평가는 약리학적 결과의 유효성과 유망한 화합물의 선택을 결정하기 위해 필수적입니다. 약물 용해도는 약물의 가용성, 제형, 투여량 및 흡수에 큰 영향을 미칩니다. 따라서 시간과 비용이 많이 드는 저용해도 화합물의 ADME 스크리닝을 피하려면 신약 개발 프로세스 초기에 이를 분석하는 것이 매우 중요합니다.

전통적으로 평형 용해도 분석은 제한된 처리량으로 화합물을 용매와 함께 최소 24시간 동안 흔들고 배양한 후 HPLC로 여과 및 농도를 측정하여 결정했습니다. 이러한 접근 방식은 더 이상 최신 신약 개발의 요구 사항을 충족하지 못합니다.

오늘날 마이크로플레이트 네펠로미터에서 실행되는자동화된 동용해도 스크린은 더 짧은 시간에 더 높은 처리량을 제공합니다. 이 접근법에서는 테스트할 화합물을 수용액에 연속적으로 희석하여 마이크로플레이트에 피펫팅합니다. 용해되지 않은 침전물은 빛의 산란을 통해 검출됩니다. 고농도에서는 화합물이 침전되어 현탁액을 흐리게 만들고 높은 RNU 수를 제공합니다. 농도가 용해도보다 높으면 화합물이 침전됩니다. 농도가 용해도보다 낮으면 화합물이 완전히 용해되어 투명한 용액이 됩니다. 따라서 산란과 RNU 수가 현저히 감소합니다. 일반적으로 용해성 및 불용성 단계에 대한 두 개의 선형 피팅이 데이터에 적용됩니다. 이들이 교차하는 지점을 동 용해도 점으로 간주합니다(그림 10).

이 접근법의 장점은 분석 속도와 취급의 용이성입니다. 마이크로플레이트 기반 네펠로메트릭 분석에는 피펫팅 단계만 필요하며, 용해되지 않은 잔류물로부터 용액을 여과하거나 상 분리할 필요가 없습니다. 또한 분석 설정과 측정이 동일한 마이크로 플레이트에서 수행될 수 있으므로 액체 이송 단계가 필요하지 않습니다. 마지막으로, 화합물이 용해되는 농도와 용질이 침전되기 시작하는 지점을 모두 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

일반적으로 검출된 신호는 입자 농도의 최대 3배수에 대해 선형이며 동 용해도 분석의 경우 약 20mmol/L의 검출 한계에 도달할 수 있습니다^.8

미생물 성장

마이크로플레이트 기반 네펠로메트리는흡광도 기반 OD₆₀₀ 미생물 성장 검출의 대안으로 사용할 수도 있습니다.. 박테리아가 증식함에 따라 용액에서 변동하는 세포의 수가 증가하여 산란 수준과 RNU 수가 증가합니다. 일반적으로 배양액의 직렬 희석은 광학 밀도와 RNU 수를 연관시키는 데 사용됩니다. 네펠로메트릭 방식은 흡광도 기반 방식과 비슷하지만 일반적으로 감도가 더 높습니다.

애플리케이션 노트레이저 네펠로메트리에 의한 미생물 성장 곡선 모니터링과칸디다 알비칸스의 네펠로메트릭 성장 모니터링(그림 11)은 NEPHELOstarPlus에서 성장 곡선을 효율적으로 측정할 수 있는 방법을 보여줍니다.