AlphaScreen

AlphaPlex è un ulteriore sviluppo che consente di quantificare fino a tre analiti in un singolo pozzetto utilizzando diverse microsfere accettore che emettono a lunghezze d'onda diverse. In queste microsfere, l'antracene e il rubrene sono sostituiti da chelati di terbio (per AlphaPlex 545) o di samario (per AlphaPlex 645). Gli anticorpi anti-analita biotinilati legano le microsfere donatrici di streptavidina. Gli anticorpi anti-analita corrispondenti sono coniugati alle microsfere accettore AlphaPlex o AlphaLISA. In presenza degli analiti target, l'eccitazione delle microsfere donatore e il conseguente rilascio di ossigeno singoletto innesca l'emissione di luce chemiluminescente dalle diverse microsfere accettore.

Ogni tipo di microsfera emette luce a una diversa lunghezza d'onda. Oltre ai 615 nm delle microsfere AlphaLISA, gli altri picchi di emissione sono a 545 nm per le microsfere di terbio e a 645 nm per le microsfere di samario (fig. 5). Di conseguenza, lo sviluppo di test triplex è possibile grazie all'uso delle microsfere AlphaLISA, AlphaPlex 545 e AlphaPlex 645 in un unico test.²

Come viene rilevato AlphaScreen?

La misurazione della chimica AlphaScreen viene eseguita prevalentemente su lettori di micropiastre. Poiché si tratta di una modalità di lettura indipendente, il rilevamento del saggio richiede un lettore di micropiastre con modalità di rilevamento AlphaScreen. Poiché questa tecnologia è spesso utilizzata nello screening di farmaci ad alta produttività, i lettori di micropiastre devono essere compatibili con piastre da 384 e 1536 pozzetti.

La configurazione di base del lettore di piastre AlphaScreen consiste in una sorgente di luce, filtri di eccitazione e di emissione per la selezione della lunghezza d'onda e un rilevatore a tubo fotomoltiplicatore (PMT).

Sorgente luminosa: lampada allo xeno o laser

Poiché il fotoattivatore sulle microsfere donatrici è specificamente eccitato a 680 nm, come sorgente luminosa si utilizza una lampada flash allo xeno o un laser di eccitazione specifico. Un laser AlphaScreen dedicato concentra una maggiore quantità di energia a 680 nm, superando in prestazioni le lampade allo xeno e portando a risultati migliori con una range dinamico più ampio e un migliore rapporto signal to noise.

I laser di eccitazione AlphaScreen dedicati sono comunemente disponibili sui lettori di micropiastre multimodali di fascia alta e dedicati all'HTS, come PHERAstar FSX e CLARIOstar Plus. I lettori economici sono solitamente dotati di una lampada flash allo xeno per il rilevamento di AlphaScreen.

AlphaPLEX comporta il rilevamento di diverse lunghezze d'onda di emissione. Sebbene queste possano essere misurate in sequenza, la rilevazione simultanea di due emissioni garantisce vantaggi sia in termini di qualità dei dati che di velocità, soprattutto per i saggi di screening. Di conseguenza, il rilevamento simultaneo a doppia emissione contribuisce ad aumentare la produttività dei saggi AlphaLISA-AlphaPlex a doppia emissione.

Riduzione del cross-talk

Il cross-talk è la luce proveniente da un pozzetto diverso da quello misurato che viene misurata in modo non specifico dal rivelatore e influisce negativamente sul segnale del pozzetto misurato.

Poiché la luce prodotta in un pozzetto da una reazione AlphaScreen è diffusa, può diffondersi ai pozzetti vicini e direttamente al sito di rilevamento, anche se viene misurato un altro pozzetto. Ciò comporta segnali distorti, variazioni di segnale più elevate e una minore sensibilità complessiva.

I segnali luminosi indesiderati raggiungono il rivelatore dall'alto della piastra e/o attraverso la parete dei pozzetti e devono essere trattati in modo diverso (fig. 6).

• Blocco fisico: le aperture sono accessori neri a forma di cucchiaio con un foro. Quando vengono posizionate su un pozzetto specifico, bloccano fisicamente la luce indesiderata che fuoriesce dai pozzetti vicini (fig. 6). Attraverso il foro, la luce del pozzetto di interesse raggiunge il rivelatore, mentre la luce proveniente dai pozzetti circostanti viene fisicamente bloccata.

• Riduzione del cross-talk matematico: la luce può filtrare attraverso la parete di plastica di un pozzetto, anche nelle micropiastre bianche opache. Le piastre ad alta densità (ad esempio, 1536 pozzetti) sono più suscettibili alla dispersione di luce a causa della stretta vicinanza dei pozzetti e delle loro pareti più sottili. Inoltre, i pozzetti quadrati adiacenti hanno un maggiore effetto di cross talk tra le pareti dei pozzetti rispetto a quelli rotondi a causa delle pareti condivise. Inoltre, il colore della piastra influenza il cross-talk attraverso le pareti della micropiastra: più scura è la piastra, minore è il cross-talk. Se non è possibile ottimizzare ulteriormente la piastra, è possibile applicare una riduzione matematica del cross-talk ai dati acquisiti. A tal fine, viene determinato la dispersione del segnale nei pozzetti vicini e un algoritmo corregge i dati luminescenti.

Entrambi gli strumenti di riduzione del cross-talk sono disponibili sui lettori di piastre BMG LABTECH PHERAstar FSX e CLARIOstar Plus.

Lettori di piastre AlphaScreen

Il rilevamento AlphaScreen/AlphaLISA può essere eseguito su PHERAstar FSX e CLARIOstar Plus. Poiché una fonte di eccitazione ad alta intensità è utile per il test, i lettori CLARIOstar e PHERAstarFSX sono dotati di laser a stato solido dedicati che producono luce ad alta intensità a 680 nm. Inoltre, il PHERAstarFSX offre moduli ottici AlphaPlex specifici che consentono la misurazione simultanea di due segnali Alpha.

Vantaggi della tecnologia AlphaScreen

AlphaScreen fornisce una piattaforma omogenea, sensibile e scalabile, specificamente adatta ad applicazioni di high throughput screening.

Elevato rapporto signal-to-background

Il processo di generazione del segnale è una reazione a cascata che produce un'elevata amplificazione del segnale. Ciò si traduce in un'elevata sensibilità. Inoltre, il background è basso. Ciò è dovuto principalmente al fatto che la lunghezza d'onda di eccitazione si trova nell'intervallo del rosso e a una lunghezza d'onda superiore rispetto al segnale di emissione. Ciò riduce l'autofluorescenza generata dai componenti biomolecolari che di solito vengono eccitati nell'intervallo blu-verde. Inoltre, il ritardo temporale tra l'eccitazione e l'emissione elimina ulteriormente il segnale aspecifico di autofluorescenza.

Test omogeneo

La chimica di AlphaScreen è omogenea: la rilevazione del complesso di microsfere donatore-accettore legato non richiede la separazione fisica dai componenti non legati per ridurre il segnale di fondo. Di conseguenza, non richiede fasi di separazione o lavaggio intermedie e può essere eseguito con un semplice protocollo add-and-read. Questo riduce al minimo le fasi di manipolazione e lo rende più conveniente e meno dispendioso in termini di tempo rispetto ad altri metodi. Pertanto, è particolarmente adatto per scopi di screening supportati dall'automazione. Questo è uno dei motivi della sua ampia adozione nelle applicazioni di scoperta di farmaci drug discovery e HTS.

Downscaling e miniaturizzazione

Grazie all'elevata sensibilità e al basso background, AlphaScreen è facilmente adattabile a piastre da 1536 pozzetti e può essere facilmente miniaturizzato a pochi µl senza alcuna variazione nella concentrazione dei reagenti o nella robustezza del saggio, come mostrato nella nota applicativa "Miniaturization of a cell-based TNF-α AlphaLISA assay".

Insidie nel rilevamento della tecnologia AlphaScreen

Micropiastra e manipolazione appropriate

 Le micropiastre bianche sono le più adatte per le misurazioni AlphaScreen, poiché riflettono il segnale luminoso. Le piastre nere assorbono la luce e comportano una riduzione del segnale e dello sfondo. Le piastre grigie offrono il miglior compromesso tra riduzione del cross-talk e riflessione del segnale. Informazioni dettagliate sulla scelta delle piastre sono disponibili nel nostro blog post: "La micropiastra: utilità nella pratica".

Poiché le piastre bianche hanno una fosforescenza intrinseca, emettono luce se esposte al sole o alla luce ambientale. Questo segnale aspecifico viene misurato dal lettore insieme alla luce emessa dal campione e determina un aumento del segnale dei bianchi, del background e una finestra di analisi ridotta. Si raccomanda pertanto di preparare le piastre bianche al buio o di lasciarle al buio per circa 15 minuti prima della misurazione. 

Illuminazione dell'ambiente

La chimica AlphaScreen è sensibile alla luce. Idealmente, dovrebbe essere preparata ed eseguita in condizioni di luce ridotta (meno di 100 Lux). Poiché ciò non è sempre possibile, una stanza chiusa dovrebbe essere dotata di illuminazione con filtro verde. Gli apparecchi di illuminazione nelle immediate vicinanze dell'area di lavoro e/o del lettore di piastre devono essere coperti con filtri verdi. È stato dimostrato che l'uso di filtri verdi è quasi altrettanto efficace che eseguire il saggio al buio (fig. 7).

Le piastre da incubare per periodi prolungati devono essere protette dalla luce - coperte con un panno scuro, un foglio di alluminio o una scatola di cartone. Evitare di esporre la micropiastra o il lettore di piastre al sole diretto o alla luce intensa.

Temperatura ambientale

La chimica di AlphaScreen è sensibile alla temperatura. Pertanto, è necessario evitare forti fluttuazioni della temperatura ambiente, in quanto influenzano negativamente la generazione, l'intensità e la stabilità del segnale. In genere, la variazione del segnale AlphaScreen si aggira intorno all'8% per °C.³

Per evitare gradienti di intensità del segnale sulla piastra durante la lettura, i reagenti e le micropiastre devono essere equilibrati con la temperatura ambiente. Per le piastre, ciò può essere facilmente ottenuto incubandole in un incubatore THERMOstar. Il PHERAstar FSX con sistema AAS consente addirittura di impostare attivamente il lettore a qualsiasi temperatura compresa tra 18° e 45°C, raffreddando così la camera di incubazione del dispositivo a temperatura ambiente o inferiore. In questa nota applicativa, viene dimostrata la capacità del sistema AAS di mantenere una temperatura stabile, ridurre l'evaporazione e il tempo di raffreddamento da alte a basse temperature.

Terreni di coltura cellulare e sieri

I terreni di coltura cellulare come RPMI 1640, MEM e DMEM influenzano negativamente l'intensità del segnale. La presenza di un terreno di coltura al 10% determina un'attenuazione del segnale di circa il 30%. Analogamente, il 10% di siero di vitello fetale riduce il segnale di circa il 25%.3Si raccomanda pertanto di lavare i campioni cellulari con un tampone appropriato come il PBS prima di applicare la chimica AlphaScreen.

Saggi AlphaScreen

La tecnologia AlphaScreen può essere applicata per analizzare eventi di legame o biochimici in formati di piastra a 96, 384 e 1536 pozzetti per diversi contesti biologici. La tecnologia è particolarmente diffusa nella comunità dello screening dei farmaci.

AlphaScreen viene applicato in diversi saggi, come quelli funzionali per GPCR(cAMP, IP3, e fosfo-ERK1/2), saggi enzimatici(tirosina chinasi, elicasi, proteasi, fosfatasi), saggi di interazione (saggi di legame con citochine, saggi funzionali con recettori nucleari, saggi di legame ligando-recettore, proteina/proteina, proteina/DNA,proteina/peptide), saggi immunologici di tipo ELISA per la quantificazione degli analiti (TNF-α,IgG).

Saggio di legame: interazione proteina-peptide e identificazione di inibitori

Nella nota applicativaPHERAstar misura il saggio AlphaScreen per sviluppare inibitori selettivi per i domini YEATS umani, mostriamo un esempio di saggio di interazione basato su AlphaScreen.

I domini YEATS sono regolatori epigenetici. Il dominio YEATS contenente ENL è stato riconosciuto come uno dei principali responsabili di diversi tipi di leucemia acuta. L'ENL è quindi un bersaglio per la scoperta di farmaci. Per lo screening di inibitori selettivi, è stato allestito un saggio di legame istone 3 (H3) - dominio YEATS utilizzando il kit di rilevamento dell'istidina AlphaScreen. La microsfera donatrice è accoppiata tramite streptavidina all'H3 acilato e la microsfera accettore al dominio YEATS. Quando la proteina e il peptide interagiscono, le diverse microsfere si uniscono e viene generato un segnale AlphaScreen (fig. 8). Gli inibitori riducono il segnale di emissione interrompendo l'interazione H3-YEATS.

Immunodosaggio: rilevamento di fosfo-ERK1/2

Oltre all'interazione, è possibile implementare anche l'immunodosaggio. Le risposte di molti GPCR non sono facilmente misurabili negli attuali formati di dosaggio. La cascata di fosforilazione ERK porta alla fosforilazione di proteine sia citoplasmatiche che nucleari che regolano la trascrizione genica. Di conseguenza, può essere utilizzata per individuare i cambiamenti cellulari indotti dall'attivazione di GPCR.

A questo scopo, è stato utilizzato il saggio di fosforilazione ERK1/2 AlphaScreen SureFire^® su lisati cellulari. Si tratta di un saggio immunologico a sandwich. Una proteina cellulare fosforilata viene inserita tra un anticorpo anti-analita associato a una microsfera donatore rivestita di streptavidina e un anticorpo antifosfo associato a una microsfera accettore coniugata con Proteina A (fig. 9). La fosforilazione dell'analita determina un aumento del segnale luminoso. Ciò è illustrato nella nota applicativaAn AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2 assay.

Riferimenti

1. Immunodosaggio luminescente per la canalizzazione dell'ossigeno: Misurazione della cinetica di legame delle particelle mediante chemiluminescenza. Ullman, EF, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, pp. 5426-5430, giugno 1994.
2. Yasgar A, Jadhav A, Simeonov A, Coussens NP. Saggi basati su AlphaScreen: Ultra-High-Throughput Screening for Small-Molecule Inhibitors of Challenging Enzymes and Protein-Protein Interactions. Methods Mol Biol. 2016;1439:77-98. doi:10.1007/978-1-4939-3673-1_5
3. https://www.urmc.rochester.edu/MediaLibraries/URMCMedia/hts/documents/AlphaScreenPracticalGuide.pdf

AlphaScreen, AlphaLISA, AlphaPlex e ^SureFire® sono marchi registrati di PerkinElmer.