PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
Was ist Absorption?
Im Allgemeinen bezeichnet der Begriff einen Prozess, bei dem Licht mit Materie in Wechselwirkung tritt. Wenn Licht auf eine Substanz trifft, die einen Teil des Lichts aufnimmt, spricht man von Absorption. Das absorbierte Licht geht dabei nicht verloren, sondern wird in Wärme oder chemische Energie umgewandelt, wenn das absorbierende Molekül angeregt wird. Die Absorption ist ein physikalischer Prozess, der uns im Alltag begegnet, beispielsweise wenn wir Farben sehen. Weißes Licht, wie das Sonnenlicht, enthält alle Farben des sichtbaren Lichts. Scheint weißes Licht, beispielsweise Sonnenlicht, auf grünes Gras, absorbiert das Gras alle Farben außer Grün. Das grüne Licht wird wieder emittiert und gibt dem Gras so seine Farbe.
Theoretischer Hintergrund von Extinktionsmessungen
Detektionsweg in Küvetten und Mikrotiterplatten
Traditionell wurden Absorptionsmessungen in einer Küvette durchgeführt. Dazu wird eine Lösung mit einem Analyten und bekannten Absorptionseigenschaften in eine Küvette gegeben. Ein Absorptionsmessgerät bestimmt die Absorption, indem es Licht mit bekannter Intensität durch die Probe schickt und die Intensität hinter der Probe misst. Das Licht, das den Detektor nicht erreicht hat, wurde entweder absorbiert oder gestreut. Der gestreute Anteil wird durch Messung geeigneter Leerwerte separat bestimmt und von diesem Wert abgezogen, um die reine Absorption der interessierenden Substanz zu erhalten.
Das Ergebnis der Absorptionsmessungen - Transmission, Absorption und optische Dichte
Der Anteil des Lichts, der die Probe passieren kann, wird auch als Transmission bezeichnet und meist in Prozent angegeben (siehe Abb. 2). Je mehr Analyt sich in der Lösung befindet, desto mehr Licht wird von ihm absorbiert und desto geringer ist die Transmission. Die Extinktion hingegen ist der Teil des Lichts, der vom Analyten aufgenommen wurde. Sie ist der absolute Wert des Logarithmus (hoch 10) der Transmission1. Hier sind die mathematischen Gleichungen und einige Zahlen, um zu erklären, was mit Transmission und Absorption beschrieben wird:
Transmission: T =Iout /Iin
Absorptionsgrad: A =-log10T
Tabelle 1: Beispiele für Transmissions- und entsprechende Absorptionswerte
| Übertragung | Absorption |
| 0,1 (oder 10%) | 1 OD |
| 0,01 (oder 1%) | 2 OD |
| 0,001 (oder 0,1 %) | 3 OD |
Absorption in Chemie und Biowissenschaften - Quantifizierung einer Substanz in Lösung
Nach einer Absorptionsmessung wird das Ergebnis als Wert in Transmission oder optischer Dichte angegeben. Da das Ziel der Messung jedoch die Quantifizierung einer Substanz in Lösung ist, stellt sich die Frage, wie sich das Signal in einen Konzentrationswert umrechnen lässt. Im Allgemeinen gibt es zwei Möglichkeiten: die Anwendung des Beer-Lambert-Gesetzes oder die Messung einer Standardkurve parallel zu Proben unbekannter Konzentrationen.
Beer-Lambert-Gesetz
Das Beer-Lambert-Gesetz beschreibt den Zusammenhang zwischen Absorption, Weglänge und Konzentration einer absorbierenden Substanz.
A=c*d*ε
Geändert in c: c=A/(d*ε)
Beer-Lambert-Gesetz mit A - Absorptionsgrad, c - Konzentration, d - Weglänge, ε - Extinktionskoeffizient.
Es besagt, dass die Absorption linear zur Konzentration, multipliziert mit der Weglänge und dem Extinktionskoeffizienten², ist. Die Weglänge bezieht sich auf die Länge der Probe, die das Licht durchqueren muss. In einer Küvette beträgt die Weglänge beispielsweise standardmäßig 1 cm. Der Extinktionskoeffizient ist eine Substanz- und wellenlängenspezifische Konstante. Er gibt Auskunft darüber, wie stark die betreffende Substanz Licht bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert. Ein Beispiel: Der Massenextinktionskoeffizient für Rinderserumalbumin (BSA) beträgt 0,67 µl*cm-1*µg-1. Dementsprechend hat eine Lösung von 1 µg/µl BSA mit einer Schichtdicke von 1 cm eine Extinktion von 0,67 OD.
Das Beer-Lambert-Gesetz ist sehr hilfreich, da es die Quantifizierung absorbierender Substanzen ermöglicht, ohne dass weitere Reagenzien hinzugefügt werden müssen. Es unterliegt jedoch den im Folgenden dargelegten Einschränkungen.
So kann das Beer-Lambert-Gesetz nur verwendet werden, wenn
- die analysierte Substanz Licht bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert und
- die Weglänge bekannt ist.
- der Extinktionskoeffizient für den Analyten bekannt ist.
- die Absorption der Pufferreagenzien sich nicht mit der Absorption des Analyten überschneidet.
Verwendung einer Standardkurve
Wenn eines dieser Kriterien nicht zutrifft, besteht die Möglichkeit, den Analyten indirekt zu messen und/oder eine Standardkurve zu verwenden. Beispielsweise hängen kolorimetrische Assays zur Proteinquantifizierung, wie der Bradford-Assay, von einer Substanz ab, die die Absorption in Gegenwart von Proteinen erhöht. Dieser Anstieg wird sowohl in einer Standardkurve mit bekannten Proteinkonzentrationen als auch in Proben gemessen, sodass deren Konzentration berechnet werden kann.
Wie wird die Absorption bestimmt?
Lichtquelle
Für die Messung der Lichtdurchlässigkeit bzw. Absorption wird zunächst Licht benötigt. Für die Absorptionsmessung können verschiedene Lichtquellen verwendet werden. Diese unterscheiden sich in dem von ihnen abgedeckten Spektralbereich, ihrer Intensität und der Stabilität des abgegebenen Lichts.
Wolfram-Halogen-Lampen decken den Bereich von 360 nm bis über 1000 nm ab und werden aufgrund ihrer Kosteneffizienz häufig verwendet. Xenon-Blitzlampen hingegen decken den Spektralbereich von 220 nm bis 1000 nm ab und erfassen somit auch den UV-Bereich. Damit ist die Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren (260 nm) und Proteinen (280 nm) möglich. Die Absorptions-Mikroplatten-Reader von BMG LABTECH sind mit einer Xenon-Blitzlampe ausgestattet und bieten somit maximale Flexibilität, um jede Wellenlänge zwischen 220 und 1000 nm oder das gesamte Wellenlängenspektrum zu messen.
Probe
Die interessierenden Flüssigkeiten müssen entweder in eine Küvette oder in eine Mikroplatte überführt werden, um ihre Absorption zu messen. Das Material der Küvette und der Mikroplatte ist immer klar, um eine maximale Lichtdurchlässigkeit zu gewährleisten, da für den Forscher nur die Absorption der Lösung von Interesse ist. Es gibt jedoch verschiedene Materialien, die sich voneinander unterscheiden. Am häufigsten wird Polystyrol verwendet, das verändert werden kann, um spezifische Bindungseigenschaften für Zellkulturen oder ELISA-Anwendungen zu erzielen. Allerdings sind diese im UV-Bereich nicht durchlässig. Um die Absorption unter 400 nm zu messen, sind daher spezielle Platten aus zyklischem Olefin-Copolymer erforderlich.
Probenvolumen
Ein weiterer zu berücksichtigender Aspekt ist das für zuverlässige Absorptionsmessungen erforderliche Probenvolumen. Standardküvetten benötigen etwa 4,5 ml, Semi-Mikro-Volumen-Küvetten reduzieren das Volumen auf 1,5 ml und Mikro-Volumen-Küvetten kommen mit 70 µl aus. Die Küvettenmessung erfolgt horizontal: Licht wird von einer Seite in die Probe gerichtet und auf der gegenüberliegenden Seite wird das durchgelassene Licht erfasst. Daher bieten Küvetten eine standardisierte Schichtdicke von 1 cm. Dies ist einer der Hauptunterschiede zu Mikroplattenmessungen, da diese vertikal verlaufen (von oben nach unten oder von unten nach oben). Dementsprechend ändert sich die Schichtdicke mit dem Probenvolumen, sodass für ein Experiment gleiche Volumina verwendet werden müssen. Zusätzlich spielen Meniskuseffekte eine wichtige Rolle für die Schichtdicke bei Mikroplatten-Extinktionsmessungen. Dies wird in der HowTo Note: How to deal with path length and meniscus in microplates ausführlich erklärt. Messungen, die in der Mitte einer Mikroplattenvertiefung durchgeführt werden, haben bei Vorhandensein eines starken Meniskus einen viel kürzeren Weg als Messungen ohne Meniskus. Dies ist besonders wichtig, wenn die Beer-Lambert-Methode angewandt wird oder wenn die Menisken in einem Experiment stark variieren. In wässrigen Lösungen ist es möglich, meniskusabhängige Änderungen der Weglänge durch Ausnutzung der Absorption von Wasser zu korrigieren (Wasser-Peak-Weglängenkorrektur).
In der Regel werden 96-Well-Standardplatten mit einem Probenvolumen zwischen 100 und 300 µl verwendet. Dies entspricht einer ungefähren Schichtdicke von 2,9 bis 7,4 mm. Unter Umständen ist es notwendig, das Volumen der wertvollen Probe weiter zu reduzieren, ohne Kompromisse bei der Schichtdicke einzugehen. Zu diesem Zweck können Halbflächenplatten oder Platten mit höherer Dichte verwendet werden. Diese haben eine kleinere Fläche, aber die gleiche Höhe wie Standardplatten mit 96 Vertiefungen. Somit bieten sie eine hohe Schichtdicke bei geringerem Volumen.
Der geeignete Blindwert
Um Absorptionsmessungen durch unerwünschte Absorption von Pufferkomponenten, durch die Platte und durch Lichtstreueffekte zu korrigieren, wird parallel zu den Proben ein Leerwert gemessen. Ein geeigneter Blank enthält alle Bestandteile des Assays mit Ausnahme des Analyten. Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass ein Blank mit PBS oder Wasser oft nicht ausreichend ist.
Ein besonderes Augenmerk sollte auf die Partikel in den untersuchten Proben und Blindproben gelegt werden. Partikel streuen das Licht, wodurch weniger Licht den Detektor erreicht und der gemessene Extinktionswert erhöht wird. Wenn sich Partikel in der Lösung bewegen, werden sie erkannt, sobald sie den Lichtweg blockieren. Bewegen sie sich aus dem Detektionspfad heraus, werden sie nicht gemessen. Dieses Phänomen erhöht die Variabilität der Absorptionsdaten. Wenn sich die Partikel nicht aus den gemessenen Lösungen entfernen lassen, empfiehlt es sich, einen größeren Bereich der Mikroplattenvertiefung für die Absorptionsmessung abzudecken. Diese Funktion bieten alle BMG LABTECH-Geräte für Absorptionsmessungen.
Detektor für Absorptionsmessungen
Nachdem das transmittierte Licht die Probe passiert hat, muss es detektiert werden. In Mikroplatten-Readern werden üblicherweise zwei verschiedene Arten von Detektoren verwendet: entweder eine Photomultiplier-Röhre (PMT) oder ein CCD-Spektrometer. Bei PMT-basierten Systemen muss die Wellenlänge vor der Detektion ausgewählt werden. Dies geschieht durch optische Filter oder Monochromatoren, die die gewünschte Wellenlänge auswählen, bevor das Licht auf die Probe geleitet wird. Das durchgelassene Licht mit der gewünschten Wellenlänge erreicht dann den PMT. Dieser verstärkt das Signal des durchgelassenen Lichts und liefert eine Spannung, die dessen Intensität angibt. Um die Absorption über einen Wellenlängenbereich zu erfassen, verwenden PMT-basierte Systeme einen Monochromator, der nacheinander die gewünschte Wellenlänge für jeden Punkt im Spektrum auswählt und misst.
Dies ist der Hauptunterschied zum zweiten Typ von Absorptionsdetektoren: dem Spektrometer. Es spaltet das durchgelassene Licht in verschiedene Wellenlängen auf, die auf einen CCD-Detektor gerichtet werden. Dieser erfasst die Intensität aller Wellenlängen auf einmal. So können sowohl Spektren als auch Messungen einzelner oder weniger Wellenlängen in ähnlich kurzer Zeit erfasst werden. Die Geräte von BMG LABTECH verwenden beispielsweise UV/vis-Spektrometer für Absorptionsmessungen, die ein ganzes Spektrum (220–1000 nm) in weniger als einer Sekunde erfassen.
