AlphaScreen

AlphaPlexは、異なる波長で発光する複数のアクセプタービーズを使用することで、1ウェルで最大3つの分析対象物の定量を可能にする発展版です。AlphaPlex用ビーズでは、アントラセンとルブレンはテルビウムキレート（AlphaPlex 545用）またはサマリウムキレート（AlphaPlex 645用）で置換されています。ビオチン化された抗アナライト抗体は、ストレプトアビジンビーズに結合します。ターゲット物質の存在下で、ドナービーズが励起され、一重項酸素が放出されると、結合に応じて、それぞれのアクセプタービーズから化学発光が起きます。

それぞれのビーズは異なる波長で発光します。AplhaLISAビーズの615 nmに加え、テルビウムビーズの545 nmとサマリウムビーズの645 nmに発光ピークがあります（図5）。つまり、AlphaLISA、AlphaPlex 545、AlphaPlex 645アクセプタービーズを1ウェルのアッセイに使用することで、トリプレックスアッセイの開発が可能になるのです2。

AlphaScreenはどのように検出されるか？

AlphaScreenの測定は、主にマイクロプレートリーダーで行われます。独立した測定モードであるため、アッセイ検出にはAlphaScreen検出モードを備えたマイクロプレートリーダーが必要です。この技術はしばしば創薬のハイスループットスクリーニングに使用されるので、プレートリーダーは384と1536ウェルプレートに対応している必要があります。

AlphaScreenプレートリーダーの基本セットアップは、光源、波長選択のための励起・発光フィルター、光電子増倍管（PMT）検出器から構成されています。

光源：キセノンランプまたはレーザー

ドナービーズ上の光増感剤は680nmで特異的に励起されるため、キセノンフラッシュランプまたは専用の励起レーザーが光源として使用されます。AlphaScreen専用レーザーは、680 nmでより多くのエネルギーを 集光 し、キセノンランプを凌駕し、より広いダイナミックレンジと増大したS/N比を持つより良い結果をもたらします。

ハイエンドのHTS用マルチモードマイクロプレートリーダーであるPHERAstar FSXや CLARIOstarPlusには専用のAlphaScreen励起レーザーが搭載されています。低価格のリーダーは、キセノンフラッシュランプがAlphaScreen検出用として使用されています。

AlphaPlexは異なる発光波長を検出します。これらは波長を切り替えての連続測定で測定できますが、2つの発光の同時検出は、特にスクリーニングアッセイにおいて、データ品質とスピードの両方を保証することになります。したがって、二波長同時検出は、デュアルエミッションであるAlphaLISA-AlphaPlexアッセイのスループット向上に 役立ちます 。

クロストークの補正

クロス トークとは、 測定ウェル以外からの光が非特異的に測定され、測定ウェルのシグナルに悪影響を与えることです。

AlphaScreen反応によってウェル内で生成された光は拡散性であるため、別のウェルが測定されているにもかかわらず、隣のウェルや直接検出部方向に広がる可能性があります。これは、シグナルの偏りやシグナルのばらつき、全体的な感度の低下につながります。

クロストークシグナルは、プレートの上方および/またはウェルの壁を通して検出器に到達するため、別の対処方法が必要です（図6）。

• >物理的ブロック： アパチャーは 、穴のあいた黒いスプーン状のアクセサリーです。特定のウェル上に配置することで隣のウェルからこぼれる不要な光を物理的にブロックします（図6）。穴を通して、測定しているウェルの光のみが検出部に届き、周囲からの光は物理的に遮断されます。

• >数理的なクロストークの低減： 光は 、白色の不透明マイクロプレートであっても、ウェルのプラスチック壁を通して差し込むことができます。高密度のプレート（例えば1536ウェル）は、ウェルが近接し、壁が薄いため、光漏れの影響を受けやすいです。特に隣接する四角いウェルは、壁が共有されているため、丸いウェルよりも壁越しのクロストークが高くなります。また、プレートの色はマイクロプレートの壁を通したクロストークに影響し、プレートの色が濃いほどクロストークは低くなります。プレートを最適化することが不可能な場合、数学的クロストーク低減法を測定データに適用することができます。あらかじめ隣接ウェルへのシグナルの漏れ込みを算出し、アルゴリズムで発光データを補正するのです。

この両方のクロストーク補正ツールは、BMG LABTECHプレートリーダーPHERAstar FSX および CLARIOstar Plusで利用可能です。

AlphaScreen用プレートリーダー

AlphaScreen/AlphaLISA の検出は、PHERAstarFSX および CLARIOstarPlus で実行できます。高輝度な励起光源はアッセイに有益であるため、CLARIOstarとPHERAstar FSXには、 680nmの高輝度光を発生する専用のソリッドレーザーが搭載されています。さらに、PHERAstar FSXには 、2つのアルファシグナルを同時に測定できるAlphaPlex専用オプティックモジュールがあります。

AlphaScreenテクノロジーの利点

AlphaScreenは、ホモジニアスで高感度、微量化が可能なハイスループットスクリーニングに適したアプリケーションです。

高いS/B比

シグナル生成プロセスは、高いシグナル増幅を生み出すカスケード反応のため、感度が高くなります。また、バックグラウンドも低いのも特徴です。これは、励起波長が赤色領域で、発光シグナルよりも高い波長であることの結果です。通常青緑色領域で励起した際に生体分子成分から発生する自家蛍光を、680nmでの励起では発生しません。さらに、励起と発光の間の時間遅延は、自家蛍光ノイズをさらに減少させます。

ホモジニアスアッセイ

AlphaScreen はホモジニアス系です：結合したドナー・アクセプタービーズ複合体の検出は、バックグラウンドを減らすために結合していない成分から物理的に分離する必要がありません。したがって、中間的な分離や洗浄ステップを必要とせず、シンプルな混ぜて→測定する手順が実行可能です。これにより、分注操作が最小限に抑えられ、他の方法よりも簡便で時間がかかりません。この特性から、自動化をサポートするスクリーニング目的に特に適しています。これが創薬や HTSで多く採用されている理由のひとつです。

ダウンスケールと少量化

AlphaScreenは高感度でバックグラウンドが低いため、1536ウェルプレートに容易に応用でき、アプリケーションノート "Miniaturization of a cell-based TNF-α AlphaLISA assay"に示されているように、試薬濃度やアッセイの堅実性を損なうことなく、数µlまで容易にスケールダウンができます。

アルファスクリーン技術の注意点

適切なマイクロプレートと取り扱い

白色マイクロプレートは光シグナルを反射するため、AlphaScreen測定に最適です。黒色プレートは光を吸収し、シグナルとバックグラウンドの両方が低減します。灰色プレートは、クロストークの減少とシグナル反射のバランスに優れています。プレートの選択に関する詳細な情報は、当社のブログ記事でご覧いただけます：「The microplate: utility in practice.」

白色プレートは固有の燐光があるため、太陽光や室内光にさらされると発光します。この非特異的シグナルは検体からの発光とともにリーダーで測定されるため、ブランク値やバックグラウンドが増加し、アッセイウインドウが狭くなります。したがって、白色プレートは暗所で調製するか、測定前に約15分間暗所に放置することが推奨されます。

環境照明

AlphaScreen法は光に敏感です。薄暗い環境（100ルクス未満）で調製・実施することが理想的です。常にこれが可能とは限らないため、密閉された部屋で緑色フィルター付き照明を設置する、作業スペースおよび/またはプレートリーダーの直近にある照明器具は、緑色フィルターで覆う　などの必要があります。緑色フィルターの使用は、暗所でのアッセイ実施とほぼ同等の効果があることが示されています（図7）。

長時間インキュベーションするプレートは、暗めの布、アルミホイル、段ボール箱などで覆い、光から保護します。マイクロプレートやプレートリーダーを直射日光や強い光にさらさないようにしてください。

環境温度

AlphaScreen の化学反応は温度に敏感です。そのため、室温の急激な変動は、シグナルの発生、強度、安定性に悪影響を及ぼすので避ける必要があります。一般的に、AlphaScreenのシグナル変動は1℃あたり約8%です3。

読み取り中のプレート全体でシグナル強度の勾配が生じないように、試薬とマイクロプレートは室温で平衡化しておく必要があります。プレートの場合、THERMOstarのようなインキュベーターで温度調整することで簡単に達成できます。AASシステム搭載のPHERAstar FSXでは、リーダーを18～45 °Cの間の任意の温度に積極的に設定することもでき、これによって装置のプレート可動域を室温以下に冷却することができます。 本アプリケーションノートでは、安定した温度を維持し、蒸発を抑え、高温から低温への冷却時間を短縮するAASシステムの能力を実証しています。

細胞培養培地と血清

RPMI1640、MEM、DMEMなどの細胞培養培地はシグナル強度に悪影響を及ぼします。10%の培養液が存在すると、シグナルは約30%も消光します。同様に、10%の胎児牛血清はシグナルを約25%減少させます3。したがって、AlphaScreen法を適用する前に、PBSのような適切なバッファーで細胞サンプルを洗浄することが推奨されます。

AlphaScreenアッセイ

AlphaScreen技術は、様々な生物学的環境において、96、384、1536ウェルプレート形式で結合反応や生化学的反応を分析するのに応用することができます。この技術は、特に創薬スクリーニングの分野で広く普及しています。

AlphaScreenは、GPCR機能アッセイ（cAMP、IP3、 phospho-ERK1/2)、酵素アッセイ(チロシンキナーゼ、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ)、相互作用アッセイ(サイトカイン結合アッセイ、核内受容体機能アッセイ、リガンド-受容体結合アッセイ、タンパク質-タンパク質、タンパク質-DNA、タンパク質-ペプチド)、分析物定量のためのELISA様イムノアッセイ(TNF-α、IgG)など様々なアッセイに適用されます。

結合アッセイ：タンパク質-ペプチド相互作用と阻害剤の同定

アプリケーションノート「PHERAstar measures AlphaScreen assay to develop selective inhibitors for the human YEATS domains」では、AlphaScreenベースの相互作用アッセイの例を示しています。

YEATSドメインはエピジェネティックな制御因子です。YEATSを含むENLは、複数の急性白血病の主要な発症因子として確認されています。したがってENLは創薬ターゲットとなります。選択的阻害剤をスクリーニングするため、AlphaScreenヒスチジン検出キットを用いたヒストン3（H3）-YEATSドメイン結合アッセイを確立しました。ドナービーズはストレプトアビジンを介してアシル化H3に結合し、アクセプタービーズはYEATSドメインに結合します。タンパク質とペプチドが相互作用すると、異なるビーズが接近しAlphaScreen信号が発生します（図8）。阻害剤は、H3-YEATS相互作用を阻害することにより、発光シグナルを減少させます。

イムノアッセイ：リン酸化ERK1/2の検出

相互作用に加え、イムノアッセイも実施実施可能です。多くのGPCRに対する応答は、現行の測定法では容易に測定できません。ERKリン酸化カスケードは、遺伝子転写を調節する細胞質と核タンパク質の両方のリン酸化をもたらします。したがって、GPCRの活性化によって誘発される細胞変化のスクリーニングに利用できるのです。

この目的のために、AlphaScreenSureFire® ERK1/2 リン酸化アッセイを細胞溶解液で使用しました。これはサンドイッチイムノアッセイです。リン酸化された細胞内タンパク質は、ストレプトアビジンコートされたドナービーズに結合した抗アナライト抗体と、プロテインA結合アクセプタービーズに結合した抗リン酸化抗体との間にサンドイッチされ（図9）、分析対象のリン酸化により光信号が増加します。この詳細はアプリケーションノート「An AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2 assay」で示されています。

参考文献

1. 発光酸素チャネリングイムノアッセイ：化学発光による粒子結合動態の測定。Ullman, EF, et al.Natl. Acad.Sci.USA、91巻、5426-5430頁、1994年6月。
2. Yasgar A, Jadhav A, Simeonov A, Coussens NP.AlphaScreenベースのアッセイ：挑戦的な酵素およびタンパク質-タンパク質相互作用の低分子阻害剤の超高スループットスクリーニング。Methods Mol Biol. 2016;1439:77-98. doi:10.1007/978-1-4939-3673-1_5
3. https://www.urmc.rochester.edu/MediaLibraries/URMCMedia/hts/documents/AlphaScreenPracticalGuide.pdf

AlphaScreen、AlphaLISA、AlphaPlex、^SureFire® はパーキンエルマーの登録商標です。