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Qu'est-ce que l'absorbance ?
En général, l'absorption est un processus d'interaction entre la lumière et la matière. Lorsque la lumière touche quelque chose qui absorbe une partie de la lumière, on parle d'absorbance. Bien entendu, la lumière absorbée n'est pas perdue ; elle est transformée en chaleur ou en énergie chimique lorsque la molécule absorbante est excitée. L'absorption est un processus physique que nous rencontrons tous les jours lorsque nous voyons des couleurs : La lumière blanche, comme la lumière du soleil, contient toutes les couleurs de la lumière visible. Lorsqu'elle brille sur l'herbe verte, l'herbe absorbe toutes les couleurs sauf le vert. La lumière verte est réémise et c'est ce qui donne à l'herbe sa couleur.
Contexte théorique des mesures d'absorbance
Chemin de détection dans les cuvettes et les microplaques
Traditionnellement, les mesures d'absorbance sont effectuées dans une cuvette : Une solution contenant un analyte dont les caractéristiques d'absorbance sont connues est placée dans une cuvette. Un lecteur d'absorbance détermine alors l'absorbance en envoyant une lumière d'intensité connue à travers l'échantillon et en détectant l'intensité derrière l'échantillon. La lumière qui n'a pas atteint le détecteur a été soit absorbée, soit diffusée. La partie diffusée est déterminée séparément en mesurant des blancs appropriés et est soustraite de cette valeur pour obtenir l'absorbance pure de la substance d'intérêt.
Le résultat des mesures d'absorbance - transmission, absorbance et densité optique
La partie de la lumière qui peut traverser l'échantillon est également appelée transmission et est principalement exprimée en pourcentage (Fig. 2). Plus la solution contient d'analyte, plus elle absorbe de lumière et plus la transmission est faible. L'absorbance, en revanche, est la partie de la lumière qui a été absorbée par l'analyte. C'est la valeur absolue du logarithme (à la puissance 10) de la transmission1. Voici les équations mathématiques et quelques chiffres qui expliquent ce que décrivent la transmission et l'absorbance :
Transmission : T =Iout /Iin
Absorbance : A =-log10T
Tableau 1 : Exemples de valeurs de transmission et d'absorbance
| Transmission | Absorbance |
| 0,1 (ou 10 %) | 1 OD |
| 0,01 (ou 1%) | 2 OD |
| 0,001 (ou 0,1%) | 3 OD |
L'absorbance en chimie et en sciences de la vie - quantifier une substance en solution
Après avoir effectué une mesure d'absorbance, le résultat est une valeur donnée soit en transmission, soit en densité optique. Toutefois, l'objectif de la mesure étant la quantification d'une substance en solution, la question évidente est de savoir comment convertir le signal en valeur de concentration. En général, il y a deux façons de procéder : en utilisant la loi de Beer-Lambert ou en mesurant une courbe standard parallèlement à des échantillons de concentrations inconnues.
Loi de Beer-Lambert
La loi de Beer-Lambert décrit la relation entre l'absorbance, la longueur du trajet et la concentration d'une substance absorbante :
A=c*d*ε
Remplacé par c : c=A/(d*ε)
Loi de Beer-Lambert avec A - Absorbance, c - concentration, d - longueur du trajet, ε - coefficient d'extinction.
Elle indique que l'absorbance est linéaire par rapport à la concentration multipliée par la longueur du trajet et le coefficient d'extinction2. La longueur du trajet correspond à la longueur de l'échantillon que la lumière doit traverser. Par exemple, dans une cuvette, le trajet est normalisé à 1 cm. Le coefficient d'extinction est une constante spécifique à une substance absorbante et à une longueur d'onde spécifique, généralement le maximum d'absorbance de la substance. Il fournit des informations sur la force avec laquelle la substance spécifique absorbe la lumière à la longueur d'onde spécifique. À titre d'exemple, le coefficient d'extinction de masse de l'albumine sérique bovine (BSA) est de 0,67 µl*cm-1*µg-1. Par conséquent, une solution de 1 µg/µl de BSA avec une longueur de trajet de 1 cm a une absorbance de 0,67 OD.
La loi de Beer-Lambert est très utile car elle permet de quantifier les substances absorbantes sans qu'il soit nécessaire d'ajouter d'autres réactifs. Cependant, elle est limitée comme indiqué ci-dessous.
La loi de Beer-Lambert ne peut être utilisée que si
- l'analyte absorbe la lumière à une longueur d'onde spécifique
- la longueur du trajet est connue
- le coefficient d'extinction de l'analyte est connu
- l'absorbance des réactifs tampons ne se superpose pas à l'absorbance de l'analyte.
Utilisation d'une courbe standard
Si l'un de ces critères ne s'applique pas, il est possible de mesurer indirectement les analytes et/ou d'utiliser une courbe standard. Par exemple, les tests colorimétriques de quantification des protéines, tels que le test de Bradford, dépendent d'une substance qui augmente l'absorbance en présence de protéines. L'augmentation est mesurée dans une courbe standard avec des concentrations connues de protéines ainsi que dans des échantillons, de sorte que leur concentration peut être calculée.
Comment l'absorbance est-elle détectée ?
Source de lumière
Cela se passe de commentaire : la mesure de la transmission/absorption de la lumière nécessite d'abord de la lumière. Différentes sources lumineuses peuvent être utilisées pour les mesures d'absorbance. Elles diffèrent par la gamme spectrale qu'elles couvrent, par leur intensité et par la stabilité de la lumière qu'elles émettent.
Les lampes halogènes au tungstène couvrent la plage de 360 nm à plus de 1000 nm et sont souvent utilisées en raison de leur rentabilité. Les lampes flash au xénon, quant à elles, couvrent la région spectrale allant de 220 nm à 1000 nm et couvrent la gamme UV du spectre. Elles permettent ainsi la détection et la quantification des acides nucléiques (260 nm) et des protéines (280 nm). Les lecteurs de microplaques d'absorbance BMG LABTECH sont équipés d'une lampe flash au xénon pour les mesures d'absorbance et offrent ainsi une flexibilité maximale pour mesurer n'importe quelle longueur d'onde entre 220 et 1000 nm, ou tout le spectre des longueurs d'onde.
Échantillon
Les liquides d'intérêt doivent être transférés soit dans une cuvette, soit dans une microplaque afin de mesurer leur absorbance. Le matériau de la cuvette et de la microplaque est toujours transparent pour assurer une transmission maximale de la lumière, car c'est l'absorbance de la solution et non celle du matériau qui intéresse le chercheur. Cependant, divers matériaux sont courants et diffèrent d'un matériau à l'autre. Le polystyrène est le plus souvent utilisé et peut être modifié pour fournir des caractéristiques de liaison spécifiques, que ce soit pour la culture cellulaire ou les applications ELISA. Cependant, ils ne sont pas transmissifs dans la gamme des UV, ce qui nécessite l'utilisation de plaques spéciales en copolymère d'oléfine cyclique pour mesurer l'absorbance en dessous de 400 nm.
Volume de l'échantillon
Un deuxième aspect à prendre en compte est le volume d'échantillon nécessaire pour obtenir des mesures d'absorbance fiables. Les cuvettes standard nécessitent environ 4,5 ml, tandis que les cuvettes semi-micro permettent de réduire le volume à 1,5 ml et que les cuvettes micro-volume se contentent de 70 µl. La mesure en cuvette est horizontale : la lumière est dirigée d'un côté vers l'échantillon et la lumière transmise est détectée de l'autre côté. Par conséquent, la géométrie des cuvettes permet d'obtenir une longueur de trajet normalisée de 1 cm. C'est l'une des principales différences avec les mesures en microplaques, qui se déroulent verticalement (de haut en bas ou de bas en haut). Par conséquent, la longueur du trajet varie également en fonction du volume de l'échantillon et nécessite l'utilisation de volumes égaux pour une expérience. En outre, les effets de ménisque jouent un rôle important pour la longueur de trajet dans les mesures d'absorbance en microplaque, comme expliqué en détail dans la note explicative : Comment traiter la longueur de trajet et le ménisque dans les microplaques. Les mesures effectuées au milieu d'un puits de microplaque ont un trajet beaucoup plus court en présence d'un ménisque important qu'une mesure sans ménisque. Ceci est particulièrement important lors de l'application de la méthode de Beer-Lambert ou lorsque les ménisques varient fortement dans une expérience. Dans les solutions aqueuses, il est possible de corriger les changements de longueur de trajet dépendant du ménisque en exploitant l'absorbance de l'eau(correction de la longueur de trajet du pic de l'eau).
Des plaques standard à 96 puits sont généralement utilisées avec des volumes d'échantillons compris entre 100 et 300 µl, ce qui correspond à une longueur de trajet approximative de 2,9 à 7,4 mm. Il peut être nécessaire de réduire encore le volume de l'échantillon précieux sans compromettre la longueur du trajet. À cette fin, des plaques à demi surface ou à densité plus élevée peuvent être utilisées. Elles offrent une surface de puits plus petite mais la même hauteur que les plaques standard à 96 puits, ce qui permet d'obtenir des longueurs de trajet élevées avec des volumes plus faibles.
Le blanc approprié
Afin de corriger les mesures d'absorbance de l'absorbance indésirable provenant des composants du tampon, de la plaque et des effets de diffusion de la lumière, un blanc est mesuré parallèlement aux échantillons. Le blanc approprié contient tous les composants de l'essai, à l'exception de l'analyte. Inversement, cela signifie qu'un blanc de PBS ou d'eau est souvent insuffisant.
Une attention particulière doit être accordée aux particules présentes dans les échantillons analysés et les blancs. Les particules diffusent la lumière et augmentent la valeur d'absorbance mesurée puisque moins de lumière atteint le détecteur. Lorsque les particules se déplacent dans la solution, elles sont détectées lorsqu'elles bloquent le trajet de la lumière. Lorsqu'elles se déplacent hors du chemin de détection, elles ne sont pas mesurées. Ce phénomène augmente la variabilité des données d'absorbance. Si les particules ne peuvent pas être éliminées des solutions mesurées, il est recommandé de couvrir une plus grande surface du puits de la microplaque dans la mesure de l'absorbance, une caractéristique que tous les appareils BMG LABTECH offrent pour les mesures d'absorbance.
Détecteur de mesures d'absorbance
Une fois que la lumière transmise a traversé l'échantillon, elle doit être détectée. Deux types de détecteurs sont couramment utilisés dans les lecteurs de microplaques: un tube photomultiplicateur (PMT) ou un spectromètre CCD. Les systèmes basés sur un PMT nécessitent la sélection de la longueur d'onde avant la détection. Pour ce faire, des filtres optiques ou des monochromateurs sélectionnent la longueur d'onde souhaitée avant qu'elle ne soit guidée vers l'échantillon. La lumière transmise de la longueur d'onde souhaitée atteint alors le PMT. Le PMT amplifie le signal de la lumière transmise et produit une tension indiquant son intensité. Afin de balayer l'absorbance sur une gamme de longueurs d'onde, les systèmes basés sur les PMT utilisent un monochromateur qui sélectionne la longueur d'onde souhaitée pour chaque point du spectre et les mesure de manière séquentielle.
C'est la principale différence avec le deuxième type de détecteurs d'absorbance, le spectromètre. Il divise la lumière transmise en différentes longueurs d'onde, qui sont dirigées vers un détecteur CCD, capturant l'intensité de toutes les longueurs d'onde à la fois. De cette manière, les spectres ainsi que les mesures d'une seule ou de quelques longueurs d'onde peuvent être acquis en un temps similaire. Par exemple, les instruments BMG LABTECH utilisent desspectromètres UV/vis pour les mesures d'absorbance qui capturent un spectre entier (220 1000 nm) en moins d'une seconde.
