PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
¿Qué es AlphaScreen?
AlphaScreen® ( ALPHA por Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) es una química basada en microesferas que se utiliza para estudiar las interacciones entre moléculas en una microplaca. Desarrollada originalmente como metodología para ensayos de diagnóstico denominados LOCI® ( Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay) en 19941, en la actualidad la tecnología AlphaScreen (tecnología Alpha) incluye AlphaScreen, AlphaLISA® y AlphaPlexTM. Se utiliza principalmente en las ciencias de la vida con fines de cribado.
El principio fundamental de la tecnología AlphaScreen se basa en la unión de dos moléculas de interés diferentes a microesferas específicas. En caso de interacción entre las dos moléculas y la proximidad resultante de las dos microesferas, se produce una transferencia de energía de una microesfera a la otra. El resultado es la producción de una señal quimioluminiscente. La tecnología AlphaScreen se utiliza principalmente en ensayos de cribado de alto rendimiento para evaluar interacciones biomoleculares, la formación/eliminación de un sustrato o producto, modificaciones postraduccionales y para cuantificar analitos.
Además de los ensayos de interacción (incluidos ligando/receptor, proteína/proteína, proteína/ADN), la tecnología AlphaScreen también puede aplicarse a ensayos funcionales de GPCR (detección de segundos mensajeros), ensayos enzimáticos e inmunoensayos.
Tecnología AlphaScreen
Los ensayos AlphaScreen se basan en dos tipos de microesferas recubiertas de hidrogel, denominadas microesferas donantes y receptoras. Los dos tipos de microesferas contienen sustancias químicas diferentes que son clave para la generación de la señal luminosa. La perla donante contiene un fotosensibilizador que, al ser excitado por la luz a 680 nm, convierte el oxígeno (O2) en una forma excitante, el oxígeno singlete (1O2). Las moléculas de oxígeno singlete tienen un tiempo de vida reducido (vida media de 4 microsegundos) y pueden difundirse aproximadamente 200 nm en solución antes de volver al estado básico.
En ausencia de perlas aceptoras, las moléculas de oxígeno singlete vuelven al estado de reposo sin producir ninguna señal luminosa. En caso de que una perla aceptora se encuentre a menos de 200 nm, la energía se transfiere de los oxígenos singletes a la perla, lo que da lugar a la producción de luz. Las perlas aceptoras AlphaScreen contienen tres colorantes químicos, tioxeno, antraceno y rubreno. Las moléculas de oxígeno singlete reaccionan inicialmente con el tioxeno para generar luz. Ésta se transfiere al antraceno y al rubreno y da lugar a una amplia emisión de luz de 520 nm a 620 nm.2 La semivida de la reacción de desintegración de la señal es de 0,3 segundos.
En los ensayos de unión, una pareja de unión (por ejemplo, un receptor) se une al donante, mientras que la otra (por ejemplo, un ligando) a las perlas del aceptor. Cuando el receptor y el ligando interactúan, la energía química se transfiere de un tipo de microesfera al otro y se produce una señal luminosa (fig. 1). AlphaScreen también puede emplearse para ensayos de competición o de escisión. En estos casos, se mide una reducción de la intensidad de la señal.
Las microesferas donantes suelen estar disponibles como conjugados de estreptavidina, aprovechando la unión específica de la biotina a la estreptavidina para marcar biomoléculas. En cambio, las perlas aceptoras se conjugan principalmente con anticuerpos. Por lo tanto, el segundo compañero de unión suele requerir la presencia del antígeno correspondiente para unirse (fig. 2). Como alternativa, ambos tipos de microesferas pueden recubrirse directamente con los compañeros de unión mediante aminación reductora.
Como ambos tipos de microesferas tienen un diámetro de unos 250 nm, son demasiado pequeñas para sedimentar en tampones biológicos. Además, no obstruyen las puntas ni los inyectores y pueden manejarse fácilmente con equipos automatizados de manipulación de líquidos. Sin embargo, son lo bastante grandes para ser filtrados o centrifugados. El recubrimiento de hidrogel permite la conjugación de biomoléculas con las microesferas al tiempo que reduce la unión no específica y la autoagregación.
AlphaLISA
AlphaLISA es un desarrollo posterior de la tecnología AlphaScreen que se basa en las mismas microesferas donantes pero utiliza un tipo diferente de microesferas aceptoras. En las perlas AlphaLISA, el antraceno y el rubreno se sustituyen por quelatos de europio. El europio excitado emite luz a 615 nm con un ancho de banda de longitud de onda mucho más estrecho que AlphaScreen (fig. 3). Por lo tanto, la emisión de AlphaLISA es menos susceptible a la interferencia de compuestos y puede emplearse para la detección de analitos en muestras biológicas como sobrenadantes de cultivos celulares, lisados celulares, suero y plasma.
AlphaLISA permite la cuantificación de proteínas secretadas, intracelulares o de membrana celular. Para la detección de biomarcadores, AlphaLISA se emplea principalmente como inmunoensayo en sándwich. Un anticuerpo antianalito biotinilado se une a la microesfera donante de estreptavidina, mientras que un segundo anticuerpo antianalito se conjuga con las microesferas aceptoras de AlphaLISA. En presencia del analito, las microesferas se aproximan. La excitación de la microesfera donante libera moléculas de oxígeno singlete que transfieren energía a las microesferas aceptoras con emisión de luz a 615 nm (fig. 4). Alternativamente, también pueden adaptarse inmunoensayos de competición.
En comparación con los ELISA clásicos, se dice que AlphaLISA proporciona una mayor sensibilidad, un rango dinámico más amplio y un rendimiento robusto con tiempos de ensayo reducidos. Además, dado que no requiere pasos de lavado (véase más adelante), se adapta fácilmente al cribado automatizado de alto rendimiento.
AlphaPLEX
AlphaPlex es un nuevo desarrollo que permite la cuantificación de hasta tres analitos en un único pocillo mediante el uso de diferentes perlas aceptoras que emiten a longitudes de onda distintas. En estas microesferas, el antraceno y el rubreno se sustituyen por quelatos de terbio (para AlphaPlex 545) o quelatos de samario (para AlphaPlex 645). Los anticuerpos antianalitos biotinilados se unen a las perlas donantes de estreptavidina. En presencia de los analitos diana, la excitación de las microesferas donantes y la consiguiente liberación de oxígeno singlete desencadena la emisión de luz quimioluminiscente de las diferentes microesferas aceptoras.
Cada tipo de microesfera emite luz a una longitud de onda diferente. Además de los 615 nm de las microesferas AlphaLISA, los otros picos de emisión se sitúan en los 545 nm de las microesferas de terbio y en los 645 nm de las microesferas de samario (fig. 5). Por consiguiente, el desarrollo de ensayos triplex es posible mediante el uso de perlas aceptoras AlphaLISA, AlphaPlex 545 y AlphaPlex 645 en un ensayo.2
¿Cómo se detecta AlphaScreen?
La medición de la química AlphaScreen se realiza predominantemente en lectores de microplacas. Al tratarse de un modo de lectura independiente, la detección del ensayo requiere un lector de microplacas con modo de detección AlphaScreen. Como esta tecnología se utiliza a menudo en el cribado de fármacos de alto rendimiento, los lectores de placas deben ser compatibles con placas de 384 y 1536 pocillos.
La configuración básica del lector de placas AlphaScreen consta de una fuente de luz, filtros de excitación y emisión para la selección de la longitud de onda y un detector de tubo fotomultiplicador (PMT).
Fuente de luz: lámpara de xenón o láser
Dado que el fotosensibilizador de las microesferas donantes se excita específicamente a 680 nm, se utiliza como fuente de luz una lámpara de xenón o un láser de excitación específico. Un láser AlphaScreen específico concentra más energía a 680 nm, superando a las lámparas de xenón y obteniendo mejores resultados con un rango dinámico más amplio y una mayor relación señal/ruido.
Los láseres de excitación AlphaScreen dedicados suelen estar disponibles en lectores de microplacas multimodo de gama alta y dedicados a HTS, como PHERAstarFSX y CLARIOstarPlus. Los lectores económicos suelen estar equipados con una lámpara de flash de xenón para la detección AlphaScreen.
AlphaPLEX implica la detección de diferentes longitudes de onda de emisión. Aunque éstas pueden medirse secuencialmente, la detección simultánea de dos emisiones garantiza tanto la calidad de los datos como ventajas de velocidad, especialmente para ensayos de cribado. En consecuencia, la detección simultánea de doble emisión ayuda a aumentar el rendimiento con ensayos AlphaLISA-AlphaPlex de doble emisión.
Reducción de la diafonía
La interferencia cruzada es la luz procedente de cualquier pocillo, excepto del pocillo medido, que el detector mide de forma inespecífica y afecta negativamente a la señal del pocillo medido.
Dado que la luz producida en un pocillo por una reacción AlphaScreen es difusa, puede propagarse a los pocillos vecinos y directamente al sitio de detección, aunque se mida otro pocillo. Esto conduce a señales sesgadas, mayores variaciones de señal y menor sensibilidad general.
Las señales luminosas no deseadas llegan al detector desde la parte superior de la placa y/o a través de la pared de los pocillos y deben tratarse de forma diferente (fig. 6).
- Bloqueo físico: las aperturas son accesorios negros en forma de cuchara con un orificio. Cuando se colocan en un pocillo específico, bloquean físicamente la luz no deseada que se derrama desde los pocillos vecinos (fig. 6). A través del orificio, la luz del pocillo de interés llega al detector, mientras que la luz procedente de sus alrededores queda bloqueada físicamente.
- Reducción de la diafonía matemática: la luz puede atravesar la pared de plástico de un pocillo, incluso en microplacas blancas opacas. Las placas de mayor densidad (por ejemplo, de 1536 pocillos) son más susceptibles a las fugas de luz debido a la proximidad de los pocillos y a sus paredes más finas. Además, los pocillos cuadrados adyacentes tienen una mayor diafonía que los redondos debido a que comparten paredes. Además, el color de la placa influye en la diafonía a través de las paredes de la microplaca: cuanto más oscura es la placa, menor es la diafonía. Si no es posible optimizar más la placa, se puede aplicar una reducción matemática de la diafonía a los datos adquiridos. Para ello, se determina la propagación de la señal a los pocillos vecinos y un algoritmo corrige los datos luminiscentes.
Ambas herramientas de reducción de diafonía están disponibles en los lectores de placas PHERAstar FSX y CLARIOstar Plus de BMG LABTECH.
Lectores de placas AlphaScreen
La detección AlphaScreen/AlphaLISA puede realizarse en los lectores de placas PHERAstar FSX y CLARIOstarPlus. Como una fuente de excitación de alta intensidad es beneficiosa para el ensayo, el CLARIOstar y el PHERAstarFSX tienen láseres de estado sólido dedicados que producen luz de alta intensidad a 680 nm. Además, el PHERAstarFSX ofrece módulos ópticos AlphaPlex específicos que permiten la medición simultánea de dos señales Alpha.
Ventajas de la tecnología AlphaScreen
AlphaScreen proporciona una plataforma homogénea, sensible y escalable a la baja, especialmente adecuada para aplicaciones de cribado de alto rendimiento.
Elevada relación señal/fondo
El proceso de generación de la señal es una reacción en cascada que produce una alta amplificación de la señal. El resultado es una alta sensibilidad. Además, el fondo es bajo. Esto se debe principalmente a que la longitud de onda de excitación se encuentra en el rango del rojo y a una longitud de onda superior a la de la señal de emisión. Esto reduce la autofluorescencia generada por los componentes biomoleculares que normalmente se excitan en el rango azul-verde. Además, el retardo temporal entre la excitación y la emisión elimina aún más el ruido autofluorescente.
Ensayo homogéneo
La química de AlphaScreen es homogénea: la detección del complejo de microesferas donante-aceptor unido no requiere la separación física de los componentes no unidos para reducir el fondo. En consecuencia, no requiere pasos intermedios de separación o lavado y puede ejecutarse con un sencillo protocolo de adición y lectura. Esto minimiza los pasos de manipulación y lo hace más cómodo y menos lento que otros métodos. Por lo tanto, es especialmente adecuado para fines de cribado automatizado. Esta es una de las razones de su gran adopción en el descubrimiento de fármacos y HTS.
Reducción de escala y miniaturización
Debido a su alta sensibilidad y bajo fondo, AlphaScreen se adapta fácilmente a placas de 1536 pocillos y se puede reducir fácilmente a unos pocos µl sin cambios en la concentración de reactivo o la robustez del ensayo, como se muestra en la nota de aplicación "Miniaturización de un ensayo TNF-α AlphaLISA basado en células".
Escollos en la detección de la tecnología AlphaScreen
Microplaca y manipulación adecuadas
Las microplacas blancas son las más adecuadas para las mediciones AlphaScreen, ya que reflejan la señal luminosa. Las placas negras absorben la luz y reducen tanto la señal como el fondo. Las placas grises ofrecen el mejor compromiso entre la reducción de la interferencia y la reflexión de la señal. Encontrará información detallada sobre la elección de la placa en la entrada de nuestro blog "La microplaca: utilidad en la práctica".
Como las placas blancas tienen una fosforescencia intrínseca, emiten luz si se exponen al sol o a la luz ambiente. Esta señal inespecífica es medida por el lector junto con la luz emitida por la muestra y da lugar a un aumento de los blancos y del fondo, y a una ventana de ensayo reducida. Por lo tanto, se recomienda preparar las placas blancas en la oscuridad o dejarlas en la oscuridad durante aproximadamente 15 minutos antes de la medición.
Iluminación ambiental
La química AlphaScreen es sensible a la luz. Lo ideal es prepararla y utilizarla en condiciones de luz tenue (menos de 100 Lux). Como esto no siempre es posible, una habitación cerrada debe estar equipada con iluminación verde filtrada. Las luminarias situadas en las proximidades inmediatas del espacio de trabajo y/o del lector de placas deben cubrirse con filtros verdes. Se ha demostrado que el uso de filtros verdes es casi tan eficaz como realizar el ensayo en la oscuridad (fig. 7).
Las placas que vayan a incubarse durante períodos prolongados deben protegerse de la luz, cubriéndolas con un paño oscuro, papel de aluminio o una caja de cartón. Evite exponer la microplaca o el lector de placas al sol directo o a una luz intensa.
Temperatura ambiente
La química de AlphaScreen es sensible a la temperatura. Por ello, deben evitarse las fluctuaciones drásticas de la temperatura ambiente, ya que afectan negativamente a la generación, intensidad y estabilidad de la señal. Típicamente, la variación de la señal AlphaScreen es de alrededor del 8% por °C.3
Para evitar gradientes de intensidad de la señal en la placa durante la lectura, los reactivos y las microplacas también deben equilibrarse con la temperatura ambiente. En el caso de las placas, esto se puede conseguir fácilmente incubándolas en un incubador THERMOstar. El sistema PHERAstar FSX con AAS permite incluso ajustar activamente el lector a cualquier temperatura entre 18° y 45°C y, de este modo, puede enfriar la cámara de incubación del dispositivo a temperatura ambiente o inferior. En esta nota de aplicación, se demuestra la capacidad del sistema AAS para mantener una temperatura estable, reducir la evaporación y el tiempo de enfriamiento de temperaturas altas a bajas.
Medios de cultivo celular y sueros
Los medios de cultivo celular como RPMI 1640, MEM y DMEM afectan negativamente a la intensidad de la señal. La presencia de un 10% de medio de cultivo provoca una atenuación de la señal de aproximadamente el 30%. Del mismo modo, un 10% de suero de ternera fetal reduce la señal en aproximadamente un 25%.3Por lo tanto, se recomienda enjuagar las muestras celulares con un tampón adecuado, como PBS, antes de aplicar la química AlphaScreen.
Ensayos AlphaScreen
La tecnología AlphaScreen puede aplicarse para analizar eventos de unión o bioquímicos en formatos de placa de 96, 384 y 1536 pocillos para diferentes entornos biológicos. La tecnología está particularmente difundida en la comunidad de cribado de fármacos.
AlphaScreen se aplica en diferentes ensayos como ensayos funcionales GPCR (cAMP, IP3, y fosfo-ERK1/2), ensayos enzimáticos (tirosina quinasa, helicasa, proteasa, fosfatasa), ensayos de interacción (ensayos de unión a citoquinas, ensayos funcionales de receptores nucleares, ensayos de unión ligando-receptor, proteína/proteína, proteína/ADN,proteína/péptido), inmunoensayos tipo ELISA para cuantificación de analitos(TNF-α,IgG).
Ensayo de unión: interacción proteína-péptido e identificación de inhibidores
En la nota de aplicación PHERAstar measures AlphaScreen assay to develop selective inhibitors for the human YEATS domains, mostramos un ejemplo de ensayo de interacción basado en AlphaScreen.
Los dominios YEATS son reguladores epigenéticos. Se ha confirmado que ENL, que contiene YEATS, es uno de los principales impulsores de varios tipos de leucemia aguda. Por tanto, ENL es una diana para el descubrimiento de fármacos. Para buscar inhibidores selectivos, se estableció un ensayo de unión histona 3 (H3) - dominio YEATS utilizando el kit de detección de histidina AlphaScreen. La microesfera donante se acopla mediante estreptavidina a la H3 acilada y la microesfera aceptora al dominio YEATS. Cuando la proteína y el péptido interactúan, las diferentes microesferas se juntan y se genera una señal AlphaScreen (fig. 8). Los inhibidores reducen la señal de emisión al interrumpir la interacción H3-YEATS.
Inmunoensayo: detección de fosfo-ERK1/2
Además de la interacción, también se pueden realizar inmunoensayos. Las respuestas de muchos GPCR no se miden fácilmente en los formatos de ensayo actuales. La cascada de fosforilación ERK produce la fosforilación de proteínas tanto citoplasmáticas como nucleares que regulan la transcripción génica. Por lo tanto, puede utilizarse para detectar cambios celulares inducidos por la activación de GPCR.
Para ello, se utilizó el ensayo de fosforilación de ERK1/2 AlphaScreen SureFire® en lisados celulares. Se trata de un inmunoensayo en sándwich. Se intercala una proteína celular fosforilada entre un anticuerpo antianalito asociado a una microesfera donante recubierta de estreptavidina y un anticuerpo antifosfo asociado a una microesfera aceptora conjugada con proteína A (fig. 9). La fosforilación del analito produce un aumento de la señal luminosa. Esto se muestra en la nota de aplicación An AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2 assay.
Referencias
- Inmunoensayo luminiscente de canalización de oxígeno: Medición de la cinética de unión de partículas por quimioluminiscencia. Ullman, EF, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, pp. 5426-5430, junio de 1994.
- Yasgar A, Jadhav A, Simeonov A, Coussens NP. AlphaScreen-Based Assays: Ultra-High-Throughput Screening for Small-Molecule Inhibitors of Challenging Enzymes and Protein-Protein Interactions. Methods Mol Biol. 2016;1439:77-98. doi:10.1007/978-1-4939-3673-1_5
- https://www.urmc.rochester.edu/MediaLibraries/URMCMedia/hts/documents/AlphaScreenPracticalGuide.pdf
AlphaScreen, AlphaLISA, AlphaPlex y SureFire® son marcas registradas de PerkinElmer.
