PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
Qu'est-ce que la fluorescence résolue dans le temps ?
La fluorescence est l'émission de lumière par une molécule lorsqu'elle est excitée par une lumière d'une longueur d'onde plus courte que celle émise.
La détection de la fluorescence peut être divisée en deux types de mesures : la fluorescence à l'état stable et la fluorescence résolue dans le temps. La principale différence entre ces deux méthodes repose sur la nature et les propriétés des molécules fluorescentes (fluorophores) utilisées et sur le temps de détection qui en découle.
L'état stable est le mode de détection de la fluorescence le plus répandu et est communément appelé "intensité de la fluorescence". Les fluorophores standard (par exemple la fluorescéine, la rhodamine, etc.) émettent de la lumière à une longueur d'onde spécifique en l'espace de quelques nanosecondes après excitation. Ce laps de temps très court entre l'excitation et l'émission permet la détection presque concomitante du signal d'émission fluorescente et de l'excitation de l'échantillon.
Le second type, la fluorescence résolue dans le temps (TRF), est surveillée en fonction du temps lors de l'excitation. Contrairement à l'intensité de fluorescence à l'état stable, la fluorescence résolue dans le temps est basée sur la détection des baisses d'intensité et/ou sur la détection retardée du signal d'émission lors de l'excitation. Dans les mesures de fluorescence résolues dans le temps, l'impulsion lumineuse d'excitation est plus courte que le temps de décroissance du signal fluorescent. La détection de la fluorescence résolue dans le temps n'est possible que lorsque le signal d'émission du fluorophore est prolongé jusqu'à la microseconde, voire la milliseconde, et n'est pas de courte durée, de l'ordre de la nanoseconde, comme c'est le cas pour les étiquettes courantes (fig.1).
Lanthanides : fluorophores dédiés à la fluorescence résolue dans le temps
Les lanthanides (Ln) sont un groupe d'éléments chimiques métalliques fluorescents uniques, souvent appelés collectivement "éléments de terre rare". Les lanthanides ont des coefficients d'absorption (excitation) très faibles et des taux d'émission lents. Cela se traduit par des temps de décroissance de fluorescence prolongés, compris entre 0,5 et 3 millisecondes (longues durées de vie). Tous les éléments lanthanides forment des cations trivalents (Ln3+) et émettent dans une solution aqueuse. En outre, leurs pics d'émission sont très nets et étroits, avec un important décalage de Stokes[1].
Les lanthanides possèdent des propriétés favorables en tant que sondes biochimiques. À l'origine, ils ont été utilisés dans des systèmes biologiques comme sondes luminescentes pour le calcium. En fait, il a été démontré que la luminescence des lanthanides est un capteur sensible des sites de liaison du Ca2+ dans les protéines[2].
Leur décroissance de fluorescence prolongée en fait des fluorophores idéaux pour les applications de fluorescence résolue dans le temps. Quatre d'entre eux, l'europium, le terbium, le samarium et le dysprosium, ont été largement utilisés dans les sciences de la vie, en particulier dans les tests immunologiques à fluorescence résolue dans le temps, l'europium et le terbium étant les plus couramment utilisés (fig.2).
Les ions europium (Eu3+), en particulier, sont fréquemment utilisés comme marqueurs pour la détection de la fluorescence à résolution temporelle dans lesessais immunologiques. Outre la fluorescence à émission longue, l'europium présente un grand décalage de Stokes (290 nm) sans chevauchement entre le spectre d'excitation et le spectre d'émission et, avec une largeur de bande de seulement 10 nm, un spectre d'émission très net à 615 nm (fig.3)[3] .
Chélates et cryptates
L'émission des lanthanides étant généralement trop faible pour les applications de fluorescence résolue dans le temps, ils ne sont généralement pas excités directement, mais intégrés dans une sorte de "cage" collectrice de lumière. Cette cage, le plus souvent un chélate ou un cryptate, permet à la fois la collecte et le transfert d'énergie aux ions lanthanides, ce qui se traduit par des intensités d'émission plus élevées (fig.4). Il convient de mentionner que le spectre d'excitation du complexe cage-lanthanide reflète le spectre d'absorption de la "cage" et non du lanthanide lui-même[4].
Outre un signal d'émission plus élevé, la chélation permet la conjugaison des ions lanthanides à des composants biologiques (anticorps, récepteurs, ligands, etc.), ce qui est indispensable pour plusieurs applications de fluorescence résolue dans le temps.
![Fig. 4: example of a europium-chelate complex in fluorescent state. Modified from [5].](https://www.bmglabtech.com/hubfs/1_Webseite/5_Resources/ABC/Detection%20Modes/time-resolved-fluorescence-fig4.webp)
Comment la fluorescence résolue dans le temps est-elle détectée ?
Comme pour la détection de l'intensité de la fluorescence, le dispositif de mesure de la fluorescence résolue dans le temps se compose d'une source lumineuse, d'un dispositif optique pour la sélection de la longueur d'onde et d'un détecteur à tube photomultiplicateur (PMT).
Le complexe lanthanide-chélate-cryptate étant généralement excité à 337 nm, une lampe flash au xénon ou un laser spécifique est utilisé comme source lumineuse pour la détection de fluorescence résolue dans le temps. Leslecteurs de plaques multimodes sont équipés d'une lampe flash au xénon à large bande, car elle offre une plus grande flexibilité pour les méthodes de détection multiples. Les lecteurs haut de gamme peuvent proposer en option un laser d'excitation de fluorescence résolue dans le temps. Le laser concentre plus d'énergie sur les longueurs d'onde d'excitation spécifiques des lanthanides et peut conduire à de meilleurs résultats avec une meilleure discrimination entre les signaux faibles et élevés. Toutefois, compte tenu de la forte excitation à environ 337 nm, il s'agit d'une source lumineuse à usage unique qui ne peut pas être utilisée comme source d'excitation pour d'autres méthodes de détection que la fluorescence résolue dans le temps.
En ce qui concerne la sélection de la longueur d'onde, les lecteurs de plaques à filtre et à monochromateur peuvent être utilisés pour la détection des essais de fluorescence résolue dans le temps. Les lecteurs à filtre étant généralement plus sensibles que les monochromateurs en raison d'une transmission lumineuse plus élevée, ils sont recommandés pour les essais TRF dont le rendement en photons est limité. En règle générale, les essais de transfert d'énergie de fluorescence résolus dans le temps sont particulièrement difficiles pour les lecteurs à base de monochromateurs.
Des tubes photomultiplicateurs (PMT) sont utilisés comme détecteurs. En raison des propriétés d'émission longue des lanthanides, dans le cas de la fluorescence résolue dans le temps, le détecteur PMT est allumé après l'excitation. Cela permet au signal autofluorescent de courte durée de s'estomper. L'intensité du signal d'émission est ensuite intégrée en fonction du temps pour une fenêtre temporelle spécifique. Ces deux paramètres sont appelés "début d'intégration" et "temps d'intégration" et sont généralement de l'ordre de la microseconde (fig. 5).
Les lecteurs de microplaques haut de gamme peuvent également être équipés de PMT à comptage de photons pour la fluorescence résolue dans le temps. Alors que les lecteurs de microplaques habituels donnent simplement une valeur d'intégration pour l'aire sous la courbe pendant le temps d'intégration, la fluorescence résolue dans le temps - détection par comptage de photons - surveille la courbe de désintégration complète du lanthanide.
Sur le lecteur PHERAstar FSX, la détection par comptage de photons permet de mesurer et d'afficher la courbe de décroissance de l'émission avec une résolution temporelle de 2 microsecondes. Cette fonction unique appelée Decay Curve Monitoring simplifie le développement des essais de fluorescence résolue dans le temps, en aidant à optimiser les paramètres de synchronisation et en améliorant ainsi la détection du signal et en réduisant le bruit de fond.
Immunodosages par fluorescence résolue dans le temps
Les immunodosages basés sur la fluorescence résolue dans le temps sont utilisés pour quantifier des molécules spécifiques telles que les protéines ou les cytokines. Ils reposent sur la reconnaissance et la liaison de la cible par des anticorps spécifiques marqués avec un fluorophore. L'analyse et la quantification du signal fluorescent fournissent indirectement des informations sur les molécules cibles. Les immunodosages sont quantitatifs, très sensibles et offrent la possibilité d'une détection multiparamétrique (multiplexage).
À l'instar destests ELISA classiques, les immunodosages à fluorescence résolue dans le temps utilisent généralement un anticorps de capture fixé au fond du puits de la microplaque. Lorsque les échantillons sont incubés dans ces puits, l'anticorps capture la molécule cible sur la plaque. Après élimination de l'échantillon non lié par lavage de la plaque, un second anticorps lié de manière covalente à un chélate de lanthanide, le plus souvent de l'europium, est ajouté. Celui-ci fixe la molécule cible tandis que le second anticorps non lié est éliminé par lavage. La quantité d'anticorps marqué au lanthanide est proportionnelle à la concentration de la molécule cible dans l'échantillon. Les immunodosages par fluorescence résolus dans le temps peuvent être réalisés comme des dosages directs ou compétitifs.
Une étape de renforcement dissociatif est nécessaire pour libérer les molécules d'europium de leur "cage" sur l'anticorps pour trois raisons : premièrement, les lanthanides absorbent mal la lumière ; deuxièmement, ils sont rarement excités directement ; et troisièmement, les chélates de lanthanide ne sont que faiblement fluorescents lorsqu'ils sont conjugués à des composants biologiques (des anticorps dans le cas présent). La dissociation est favorisée par l'ajout d'une solution spécifique communément appelée "solution d'amélioration". Outre la dissociation du lanthanide, cette solution favorise la formation d'une nouvelle "cage" de chélate qui incorpore le chromophore nécessaire à l'excitation du lanthanide. Le chélateur-chromophore dans la solution d'amélioration est utilisé pour absorber et transférer la lumière d'excitation au lanthanide, augmentant ainsi de manière significative l'intensité du signal d'émission (fig.6).
Les échantillons sont excités par une impulsion de lumière à une longueur d'onde spécifique, généralement 337 nm. La détection se fait en fonction du temps et de la décroissance du signal d'autofluorescence. Cela signifie que la détection de la fluorescence résolue dans le temps ne commence qu'après l'épuisement du signal d'autofluorescence de courte durée (microsecondes). Le signal d'émission détecté est intégré pendant une fenêtre temporelle spécifique et les données sont mesurées en tant qu'intensité intégrée, et non en tant que décroissance temporelle. La quantité d'analyte étant proportionnelle au signal d'émission résolu dans le temps, elle peut être facilement quantifiée à l'aide d'une courbe standard.
DELFIA® est l'un des tests immunologiques de fluorescence résolue dans le temps les plus couramment utilisés.
DELFIA
DELFIA (Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent Immunoassay) est un essai hétérogène de fluorescence résolue dans le temps, basé sur un lavage, développé sur un principe et un flux de travail similaires à ceux des ELISA. Il est censé surmonter les limites typiques des tests ELISA, en offrant une gamme dynamique plus large et des signaux stables qui peuvent être mesurés jusqu'à plusieurs mois après l'exécution du test. Pour la détection DELFIA, les lecteurs de plaques doivent être équipés d'une détection de fluorescence résolue dans le temps avec une excitation à 337 nm et une émission à 615 nm.
Dans les essais DELFIA, les anticorps de capture sont liés à la microplaque. Après l'ajout de l'échantillon et une série d'étapes de lavage pour éliminer l'échantillon non lié, un anticorps de détection marqué à l'europium est ajouté. Enfin, une solution de renforcement est ajoutée après une dernière série de lavages. Comme indiqué ci-dessus, les tests DELFIA nécessitent une étape de renforcement dissociatif pour produire un signal fluorescent. Cette dissociation favorise la formation d'un nouveau chélate hautement fluorescent dans une solution micellaire stable. Un exemple d'essai immunologique DELFIA est présenté dans la note d'application "Time-Resolved Fluorescence (TRF) immunoassay in 384-well format using a matched antibody pair kit and the PHERAstar FSX" (essai immunologique à fluorescence résolue dans le temps dans un format de 384 puits utilisant un kit de paires d'anticorps appariés et le PHERAstar FSX).
Bien que robustes et très sensibles, les tests DELFIA ne sont pas adaptés au criblage à haut débit, car la procédure implique des étapes de liaison, d'incubation et de lavage.
