Fluoreszenzpolarisation

Theorie der Fluoreszenzpolarisationsdetektion

Die Fluoreszenzpolarisationsdetektion basiert auf der allgemeinen Theorie der stationären Fluoreszenzdetektion, die Sie auf der Seite zur Fluoreszenzintensität finden. Darüber hinaus beruht die Detektion auf zwei Beobachtungen: Zum einen ist der Polarisationsgrad eines Fluorophors umgekehrt proportional zu seiner Umlaufgeschwindigkeit und zum anderen kann das von einem Fluorophor emittierte Licht auf verschiedenen Polarisationsebenen – typischerweise senkrecht und parallel zur Anregungsebene – unterschiedliche Intensitäten aufweisen.

Wenn planpolarisiertes Licht ein kleines (typischerweise < 1,5 kDA) und ungebundenes fluoreszierendes Molekül (den Tracer) anregt, emittiert dieses hauptsächlich unpolarisiertes Licht. Dies ist darauf zurückzuführen, dass ein kleines, freies Molekül in der Zeit zwischen Anregung und Emission in der Lösung schnell rotiert und dementsprechend Licht in verschiedenen Polarisationsebenen (unpolarisiert) emittiert.

Ist das kleine fluoreszierende Molekül dagegen an ein größeres Molekül (typischerweise > 10 kDA) gebunden, so verlangsamt dessen größeres Molekülvolumen die Rotation, was zur Emission von überwiegend in der gleichen Ebene wie die Anregungsquelle polarisiertem Licht führt (siehe Abb. 2).

Quantifizierung der Fluoreszenzpolarisation

Die Fluoreszenzpolarisation ist somit ein Maß für die Molekülrotation, die zwischen der Anregung und der Emission des Tracers stattfindet. Sie wird nach der folgenden Gleichung berechnet:

P = (F|| - F⊥)/(F|| + F⊥)

Quantitativ ist er definiert als die Differenz zwischen der Emissionsfluoreszenzintensität parallel (F||) und senkrecht (F⊥) zur Anregungslichtebene, geteilt durch die Gesamtfluoreszenzemissionsintensität.¹

Da es sich um ein Verhältnis der Lichtintensitäten handelt, ist der Wert P eine dimensionslose Zahl. Er wird häufig in Millipolarisation (mP) ausgedrückt, wobei 1 P = 1000 mP entspricht. Obwohl P-Werte zwischen -330 und 500 mP möglich sind, werden diese theoretischen Grenzen nur selten erreicht. Bei bioanalytischen Anwendungen liegen die typischen Werte zwischen 10 und 300 mP (siehe z. B. Abbildung 3).

Fluoreszenzpolarisation und Anisotropie

Der 1960 eingeführte Begriff Anisotropie wird häufig im Zusammenhang mit polarisierter Emission verwendet. Anisotropie (bezeichnet als A oder r) ist das Verhältnis der Emissionsintensitäten in der folgenden Gleichung:

r = (F|| - F⊥)/(F|| + 2 F⊥)

F|| gibt die Intensität nach vertikal polarisierter Anregung und vertikaler Polarisation des Emissionslichts an. F⊥ gibt die Intensität bei Verwendung eines vertikalen Polarisators für die Anregung und eines horizontalen Polarisators für die Emission an. ²

Fluoreszenzpolarisation und Anisotropie sind mathematisch verwandt und werden synonym verwendet. Sie werden beide aus den Emissionsintensitäten von polarisiertem und unpolarisiertem Licht abgeleitet und stellen einen Durchschnitt der gebundenen/ungebundenen Zustände eines fluoreszierenden Moleküls dar. Für die meisten Anwendungen sind die Informationsgehalte ihrer Funktionen identisch, da die Anisotropie keine zusätzlichen Informationen liefert.³

In der Regel hängt die Wahl des einen oder anderen Begriffs von praktischen Erwägungen und Gewohnheiten ab. Am häufigsten wird die Fluoreszenzpolarisation zur Beschreibung der gesamten Technologie und in der klinischen Chemie verwendet, während die Anisotropie eher in der Biophysik und Biochemie üblich ist.

Wie wird die Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen?

Die Fluoreszenzpolarisation kann mit einem Mikroplatten-Lesegerät nachgewiesen werden. Das Verfahren und der Aufbau entsprechen dabei denen zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität. Es gibt jedoch einige Unterschiede, die hauptsächlich mit der Auswahl der Polarisationsebenen zusammenhängen.

Die Probe wird durch vertikal (parallel) polarisiertes Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt. In der Regel dient eine Xenon- oder Halogenlampe als Anregungslichtquelle. Ihr weißes Licht wird entweder mit einem Filter oder einem Monochromator spektral gefiltert. Die Polarisationsebene wird durch einen speziellen Filter, den Polarisator, ausgewählt.

Der elektrische Feldvektor des natürlichen Lichts kann jede beliebige Schwingungsrichtung relativ zur Ausbreitungsrichtung annehmen. Polarisatoren sind optische Elemente – in der Regel dünne Filme –, die eine Richtung des elektrischen Vektors isolieren können. Der Anregungspolarisator befindet sich zwischen der Anregungsquelle und der Probe. Je nach Ausrichtung der vertikalen Ebene lässt er paralleles Licht zur Probe durch und blockiert senkrecht polarisiertes Licht.

Das von der Probe emittierte Licht wird entweder durch einen Filter oder einen Monochromator spektral gefiltert, um unerwünschte Wellenlängen zu entfernen. Darüber hinaus muss das emittierte Licht je nach seiner Ausrichtung zur Ebene des polarisierten Anregungslichts in parallele oder senkrechte Wellen aufgeteilt werden. Dies wird durch Emissionspolarisatoren im Lichtweg zwischen Probe und Detektor ermöglicht. Diese sind typischerweise vom gleichen Typ wie der Anregungspolarisator. Schließlich wird die Intensität der beiden polarisierten Ebenen mit einem Detektor, in der Regel einer Photomultiplier-Röhre (PMT), quantifiziert.

Die beiden Ebenen werden getrennt voneinander erfasst. Der einfachste Ansatz besteht darin, die parallele und die senkrechte Ebene mit zwei aufeinanderfolgenden Messungen zu erfassen. Dabei wird in der ersten Messung die parallele Polarisationsintensität erfasst und in der zweiten Messung der um 90° gedrehte Emissionspolarisator zur Erfassung der horizontalen (senkrechten) Ebene verwendet (siehe Abb. 4).

High-End-Fluoreszenz-Polarisationsplattenlesegeräte wie der PHERAstarFSX können dank der Simultaneous Dual Emission-Detektionstechnologie die beiden Polarisationsebenen gleichzeitig erfassen. Dieser Ansatz spart Zeit und reduziert die Variabilität, die durch zwei aufeinanderfolgende Messungen entsteht.

Überlegungen zur Fluoreszenzpolarisationsdetektion

Monochromatoren werden im Allgemeinen für die FP-Detektion nicht empfohlen, da sie eine geringe Lichtdurchlässigkeit und einen hohen Streulichtanteil aufweisen. Dies führt zu einer erhöhten Probenvariabilität, was sich negativ auf das Testfenster und die Robustheit des Tests auswirkt.

Für den Nachweis im UV-Bereich müssen die Lesegeräte mit einer Xenon-Lampe ausgestattet sein. Halogenlampen sind wegen ihrer geringen Emission unter 400 nm nicht zu empfehlen. Darüber hinaus sind spezielle UV-Polarisatoren erforderlich, da herkömmliche Polarisatoren in diesem Wellenlängenbereich eine schlechte Transmission aufweisen.

Niedrige Polarisationswerte (P) zeigen an, dass die fluoreszierenden Moleküle nicht gebunden sind, sondern sich frei in der Lösung bewegen. Hohe P-Werte deuten auf das Vorhandensein eines größeren Molekülkomplexes hin. Obwohl der Messbereich in bioanalytischen Anwendungen mit 10 bis 300 mP recht begrenzt erscheint, können mit High-End-Multimode-Mikroplattenlesegeräten wie dem PHERAstar FSX oder dem CLARIOstar Plus sehr präzise Messungen mit Standardabweichungen von ±0,5 mP erzielt werden.

Fluorophore für Fluoreszenzpolarisationstests

Die Wahl des Fluoreszenzfarbstoffs ist bei FP-Assays von entscheidender Bedeutung. Ihre Anregungs- und Emissionsspektren müssen sich von den Wellenlängen anderer, in der Lösung vorhandener Moleküle unterscheiden, um die Autofluoreszenz zu reduzieren. Zudem müssen sie eine große Stokes-Verschiebung aufweisen, um den negativen Einfluss der Lichtstreuung zu verringern. Die Fluorophore müssen sich leicht an den Tracer konjugieren lassen, ohne dessen Taumeln zu stören oder die Wechselwirkung zu beeinträchtigen. Außerdem müssen sie eine hohe Quantenausbeute (d. h. eine hohe Intensität) aufweisen sowie chemisch und photostabil sein.⁴

Am häufigsten werden Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Farbstoffe mit ähnlichen Spektren verwendet. In jüngster Zeit haben jedoch rote Farbstoffe wie Cy3B und Cy5 an Popularität gewonnen, was durch die verbesserte Leistung moderner  Mikroplatten-Lesegeräte begünstigt wird. Da ihre geringe Photonenausbeute aufgrund technischer Verbesserungen bei der Signaldetektion keine Einschränkung mehr darstellt, kann ihre Verwendung vorteilhaft sein, um durch Autofluoreszenz bedingte falsch-negative Ergebnisse, die üblicherweise im grünen und blauen Bereich emittieren, sowie falsch-positive Ergebnisse aufgrund von Lichtstreuung zu reduzieren.⁵

Vorteile der Fluoreszenzpolarisation

Unter den Ansätzen zur Untersuchung molekularer Bindungsereignisse ist die FP einzigartig. Da sie auf einer einzigen Fluoreszenzmarkierungsstrategie basiert, sind keine zusätzlichen Trennungsschritte erforderlich. Dementsprechend können im Vergleich zu herkömmlichen Methoden weniger und in der Regel kostengünstigere Reagenzien verwendet werden. Da die Probenintegrität nicht beeinträchtigt wird, können die Proben häufig wiederholt gemessen werden, sofern der pH-Wert, die Temperatur und die Viskosität konstant sind.

Die FP ermöglicht die direkte Überwachung des Verhältnisses zwischen freiem und gebundenem Tracer in einer Lösung in Echtzeit. Dadurch ist eine Gleichgewichtsanalyse mit sehr niedrigen Konzentrationen (typischerweise bis in den pikomolaren Bereich) möglich. Da es sich um ein Echtzeitverfahren handelt, sind die Experimente jedoch nicht auf das Gleichgewicht beschränkt und die Assoziations-/Dissoziationskinetik kann leicht analysiert werden.

FP ist ein homogenes Verfahren mit einem einfachen Mix-and-Read-Protokoll. Eine Trennung der zu messenden gebundenen und freien Spezies ist nicht erforderlich. Homogene Assays ermöglichen eine genauere Quantifizierung von Bindungsereignissen, da die Bindungsreaktion nicht durch zusätzliche Schritte gestört wird. Zu beachten ist jedoch, dass andere homogene Assays wie FRET, TR-FRET oder AlphaScreen^®, neben der einmaligen Markierung des Tracers weitere Markierungsreaktionen erfordern.

Darüber hinaus eliminiert die ratiometrische Natur von FP den negativen Einfluss, den die Absorption oder das Quenching von Verbindungen auf die Datenerfassung haben können, und ermöglicht eine Miniaturisierung. All diese Gründe haben zur Einführung von FP-Assays im Hochdurchsatz-Screening geführt.

Grenzen der Fluoreszenzpolarisation

Dieses Messsystem hat trotz aller Vorteile auch einige Einschränkungen. So erfordert FP große Veränderungen des Molekülvolumens, um ein maximales Signal und ein Assay-Fenster zu erzeugen. Ein Fluoreszenzpolarisations-Bindungstest kann höchstens die Interaktion zwischen einem kleinen und einem großen Molekül überwachen und setzt die Markierung des kleinsten Interaktionspartners mit einem Fluorophor voraus. In der Regel werden daher kleine Proteine oder Peptide, Zytokine und chemische Verbindungen als Tracer verwendet. Dies gewährleistet den größtmöglichen Unterschied im Molekülvolumen bei der Bindung und somit das größtmögliche Assay-Fenster. Der FP-Bindungstest ist jedoch nicht geeignet, um die Interaktion zweier großer Proteine zu beobachten.

Außerdem können Autofluoreszenz und Lichtstreuung Artefakte verursachen. Daher ist es in der Regel empfehlenswert, den Fluoreszenzhintergrund einer Vertiefung vor Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffs zu quantifizieren und von der Berechnung abzuziehen. Da die Autofluoreszenz bei höheren Wellenlängen in der Regel weniger ausgeprägt ist, können rote Farbstoffe wie BODIPY TMR oder Cy5 verwendet werden, um das Hintergrundrauschen zu minimieren⁶^,⁷.

Anwendungen: Fluoreszenzpolarisations-Bindungstest

Der FP-Bindungstest eignet sich zur Analyse molekularer Interaktionen oder Dissoziationen bei Protein-Ligand- oder Peptid-Protein-Wechselwirkungen, Protein-DNA-Wechselwirkungen sowie präfibrillärer Proteinaggregation. Darüber hinaus können damit auch störende Verbindungen und unspezifische Inhibitoren identifiziert werden.

Weitere Anwendungen umfassen die Analyse der Membranfluidität in Liposomen und mitochondrialen Membranen sowie enzymatische Assays wie Proteolyse, RNA-Synthese, Bindungskinetik und Ubiquitin-Konjugation/Dekonjugation in Echtzeit (siehe Abb. 5). Anwendungen in Echtzeit für Ubiquitin können beispielsweise beim gezielten Proteinabbau für PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) oder molekulare Klebstoffe eingesetzt werden, , einschließlich Untersuchungen ihrer Bindungsaktivität an ihre Ziele und der Kinetik der Wechselwirkungen. Mit FP-Bindungstests kann auch der gezielte Proteinabbau untersucht werden, der durch spezifische Wechselwirkungen zwischen bekannten Degronen und Ligasen entsteht.

Fluoreszenzpolarisationstests beim Screening kleiner Moleküle

In den 1990er Jahren wurde die FP in das Arzneimittel-Screening eingeführt, um den Prozess der Arzneimittelentdeckung zu erleichtern. Aufgrund ihres homogenen, schnellen und quantitativen Formats wird sie heute routinemäßig in Screening-Einrichtungen eingesetzt. Da die FP oft linear proportional zum Prozentsatz des gebundenen/freien Tracers ist, wird sie häufig zur Bestimmung der IC₅₀-Werte von Arzneimittelkandidaten eingesetzt.

Bei der Entdeckung von Arzneimitteln wurde sie zur Untersuchung verschiedener Targets, darunter GPCRs, Kinasen, Phosphatasen und Proteasen, eingesetzt. Während bei Interaktionsstudien in der Regel eine Zunahme des Molekülvolumens nachgewiesen wird, wird bei Dissoziations- und enzymatischen Abbautests in der Regel die Abnahme des Molekülvolumens als Messwert verwendet.

Die Hauptanwendungen von Fluoreszenzpolarisationsassays im Hochdurchsatzverfahren (HTS) sind die Analyse direkter molekularer Wechselwirkungen sowie enzymatischer Reaktionen. Mithilfe schneller und empfindlicher Mikroplatten-Lesegeräte ist ein effizientes Screening kleiner Moleküle für eine wachsende Zahl von Zielklassen möglich. Beispiele hierfür sind das Screening von Inhibitoren des Ubiquitinierungsregulators und Anti-Krebs-Targets CSN5 sowie das Screening von H-Prostaglandin-D-Synthase-Inhibitoren.

HomoFRET-Fluoreszenzpolarisation

Der Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ist eine gängige Methode, um Interaktionsereignisse zu untersuchen. In der Regel werden die beiden mutmaßlichen Interaktionspartner mit zwei verschiedenen Fluorophoren (Donor und Akzeptor) markiert. FRET kann jedoch auch zwischen gleichen Fluorophoren stattfinden (homoFRET). FP kann auf homoFRET angewandt werden, da der Energietransfer eine Randomisierung der Emissionspolarisation bewirkt und ein depolarisiertes Signal erzeugt. Mithilfe von homoFRET-FP können Proteinakkumulationen oder Dimerisierungsereignisse in einer Zelle untersucht werden, wie in der Application Note "Monitoring of insulin granule packaging in live cells using homoFRET-FP detection" (Abb. 6) beschrieben.

Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay

Der Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay (FPIA) wurde erstmals in der Biochemie eingesetzt. Es handelt sich um einen kompetitiven biochemischen Test, mit dem sich Antigene oder Antikörper nachweisen lassen. Dabei wird ein an ein Fluorophor gebundenes Antigen als Tracer verwendet. Dieses und ein zweites Antigen konkurrieren in der Regel um die Bindung eines ausgewählten Antikörpers. Eine hohe Tracer-Antikörper-Bindung führt in der Regel zu einem polarisierten Signal, während der freie Tracer ein unpolarisiertes Licht erzeugt, wenn das unmarkierte Antigen überwiegend vom Antikörper gebunden wird. Diese Veränderung ist proportional zur Menge des in der Probe vorhandenen Antigens.⁸

Referenzen

1. Lakowicz JR, Grundlagen der Fluoreszenzspektroskopie, dritte Auflage, 2010.
2. Jablonski A. 1960. Über den Begriff der Emissionsanisotropie. Bull l'Acad Pol Sci, Ser A 8:259-264.
3. Mocz G. Informationsgehalt der Fluoreszenzpolarisation und -anisotropie. J Fluoresc. 2006 Jul;16(4):511-24.
4. Zhang, H.; Yang, S.; De Ruyck, K.; Beloglazova, N.V.; Eremin, S.A.; De Saeger, S.; Zhang, S.; Shen, J.;Wang, Z. Fluorescence polarization assays for chemical contaminants in food and environmental analyses. TrAC Trends Anal. Chem. 2019, 114, 293-313.
5. Turek-Etienne TC, Small EC, Soh SC, Xin TA, Gaitonde PV, Barrabee EB, et al: Evaluation of fluorescent compound interference in 4 fluorescence po-larization assays: 2 kinases, 1 protease, and 1 phosphatase. J Biomol Screen. 2003;8:176-184.
6. Owicki JC. Fluoreszenzpolarisation und Anisotropie im Hochdurchsatz-Screening: Perspektiven und Grundierung. J Biomol Screen. 2000;5(5):297-306.
7. Turek-Etienne TC, Lei M, Terracciano JS, et al. Use of red-shifted dyes in a fluorescence polarization AKT kinase assay for detection of biological activity in natural product extracts. J Biomol Screen. 2004;9(1):52-61.
8. Empfindlicher Fluoreszenzpolarisations-Schnellimmunoassay zur Bestimmung von freier Mycophenolsäure in Humanserum und -plasma. Bettina Glahn-Martínez, Elena Benito-Peña, Francesca Salis, Ana B. Descalzo, Guillermo Orellana, and María C. Moreno-Bondi Analytical Chemistry 2018 90 (8), 5459-5465.