마이크로 플레이트: 실무에서의 유용성

마이크로 플레이트는 어떤 용도로 사용되나요?

마이크로플레이트는 작은 시료 튜브로 사용되는 여러 개의  웰이 있는 플레이트로 구성된 실험실 장비입니다. 마이크로리터 플레이트 또는 멀티웰이라고도 하며 일반적으로 6-, 12-, 24-, 48-, 96-, 384- 또는 1536-웰 형식으로 제공되며 96-웰 레이아웃이 가장 일반적으로 사용됩니다. 

마이크로플레이트는 많은 시료의 준비, 취급, 검사, 처리 및 관리를 용이하게 합니다. 오늘날 마이크로플레이트는 생명과학 및 제약 연구뿐만 아니라 임상 진단 및 분석 연구에서도 표준으로 사용되고 있습니다. 효소결합면역흡착분석법(ELISA) 은 가장 일반적으로 사용되는 응용 분야 중 하나입니다. 그러나 시료 보관, 여과, 분리 및 혼합, 시료 검출 및 정량화 등 생명 과학 분야에서 다양하고 광범위하게 사용되고 있습니다.

간략한 역사

마이크로플레이트는 1951년 헝가리의 미생물학자인 귤라 타카치 박사가 인플루엔자 유행으로 인해 실험실 장비가 부족해지자 만들었습니다(그림 1). 타카치는 임상 테스트를 진행하기 위해 저렴한 솔루션을 찾아야 했습니다. 그는 대량으로 테스트하는 데 너무 많은 비용이 들며, 여러 샘플을 나란히 배치하면 처리량을 크게 늘릴 수 있다는 사실을 알게 되었습니다. 이에 그는 손으로 12개의 웰(8*12 = 96개)을 8열로 배열하고 와이어 루프로 연결하여 최초의 마이크로플레이트를 만들었습니다. 이 솔루션을 통해 그는 피펫팅 시간을 절약할 수 있었습니다.

1960년대에 그의 발명은 점차 인기를 얻었고 전 세계 실험실에서 생의학 테스트의 표준 장비로 채택되었습니다.

1980년대 후반에 몰드 버전이 출시되면서 더욱 널리 보급되었습니다. 이를 통해 단위당 가격이 낮아지고 생산 능력이 증가했습니다. 그 후 몇 년 동안 마이크로플레이트는 더욱 개선되었고 과학계의 다양한 요구에 맞게 여러 가지 변형이 개발되었습니다.

1990년대에는 생체분자 스크리닝 학회(SBS)에서 특징과 모양을 표준화하기 위한 노력을 시작했습니다. 특징에는 주로 웰의 수, 모양, 치수는 물론 일반적인 치수 및 재질과 같은 속성이 포함되었습니다. 2003년에 미국표준협회(ANSI)는 웰 직경, 깊이 및 간격과 일반 치수(예: 127.76mm × 85.48mm)를 포함하는 표준화된 특징 세트를 제안하고 발표했습니다^.1

표준화는 더 폭넓은 사용으로 이어졌고, 특히 실험실 자동화와 실험실 기기 생산에 도움이 되었습니다. 그 결과 마이크로플레이트는 신약 개발과 생명과학 연구를 효과적으로 지원하는 도구로 더욱 인기를 얻게 되었습니다. 2000년에만 약 125,000,000개가 사용된 것으로 추정됩니다^.2

2010년에는 SBS와 미국실험실자동화협회(ALA)가 합병하여 미국실험실자동화 및 스크리닝학회(SLAS)가 설립되었습니다. 그 이후로 마이크로플레이트 표준은 ANSI/SLAS로 불립니다.

다양한 선택

마이크로플레이트는 웰의 개수 외에도 다양한 소재와 색상으로 제공되며 웰 모양과 용량도 다양합니다. 옵션이 많기 때문에 특정 분석에 가장 적합한 것을 선택하기가 어려울 때가 있습니다. 여기에서는 분광광도계 애플리케이션에 중점을 두면서 주요 기능을 요약해 보겠습니다.

형식 및 용량

제조업체마다 마이크로 플레이트의 크기와 웰 위치는 조금씩 다르지만 모든 마이크로타이터 플레이트는 동일한 풋프린트 치수로 제공됩니다. 웰은 일반적으로 직사각형 매트릭스로 배열되며 일반적으로 6-, 12-, 24-, 48-, 96-, 384- 및 1536-웰 형식으로 제공됩니다(그림 2). 3456웰 레이아웃도 사용할 수 있지만 자주 사용되지는 않습니다.

각 웰의 채우기 볼륨은 레이아웃에 따라 다릅니다. 가장 많이 사용되는 레이아웃은 96웰 포맷(최대 300µL/웰)입니다. 일반적으로 소형화를 위해 더 높은 밀도의 레이아웃을 사용합니다. 384-(최대 100µL/웰), 1536-(최대 15µL/웰), 심지어 3456-웰 포맷(최대 5µL/웰)은 더 많은 시료를 담을 수 있을 뿐만 아니라 시약 부피와 결과적으로 비용을 줄여줍니다(표 1).

일반적으로 효율적이고 현실적인 측정을 위해 웰에 권장되는 최소 용량은 최대 주입 용량의 1/3입니다. 따라서 표준 96웰 마이크로타이터 플레이트의 경우 100µL 이하로 내려가지 않아야 합니다.

반면적 96웰 마이크로플레이트(최대 170µL/웰)는 중간 솔루션입니다. 이는 기본적으로 96웰의 외부 치수와 웰 위치를 유지하면서 384웰 레이아웃과 동일한 웰 크기를 갖습니다. 따라서 웰이 더 작아지고 샘플 부피를 최대 50%까지 줄일 수 있습니다. 이 형식은 일반적으로 적은 양이 필요하지만 자동화 및 처리량이 필요하지 않은 경우 384-well의 대안으로 사용됩니다.

유사한 개념이 소용량 또는 소량 형식의 384웰 레이아웃("하이베이스"라고도 함)에도 적용됩니다. 이러한 플레이트는 1536웰 레이아웃과 동일한 웰 크기를 가지며 384웰 플레이트의 외부 치수와 웰 위치가 동일합니다. 마찬가지로 표준 384웰과 비교했을 때 샘플 부피를 50% 이상 줄일 수 있습니다. 부피 외에도 웰 모양도 영향을 받는데, 일반 384웰 레이아웃은 정사각형 모양의 웰을 사용하는 반면, 저부피는 원형 웰을 사용합니다.

표 1: 다양한 레이아웃의 다양한 볼륨 용량 비교.

일반적으로 고밀도 포맷(예: 1536 및 3456 웰)은 손으로 피펫팅할 수 없으므로 피펫팅 기계가 필요합니다. 384 웰에서는 여전히 수동 피펫팅이 가능하지만 번거롭고 일반적으로 권장되지 않습니다. 따라서 1536웰 또는 3456웰 마이크로플레이트 작업과 관련된 높은 처리 비용이 소형화로 인한 비용 절감과 상쇄되는지 여부를 고려해야 합니다. 이는 일반적으로 처리량이 많은 스크리닝 시설의 경우이지만 대부분의 생명과학 실험실에서는 그렇지 않습니다.

ELISA용 플레이트는 일반적으로 96개의 웰과 함께 제공되며 12개의 개별 8웰 스트립으로 구성됩니다(그림 3). 이 아키텍처는 부분적인 사용과 취급을 간소화합니다.

자료

마이크로티터 플레이트는 다양한 재료로 제조할 수 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 폴리머는 폴리카보네이트, 폴리스티렌 및 사이클로올레핀입니다. 폴리머의 선택은 광 투과, 자가 형광, 수분 흡수 및 가스 교환에 영향을 미치며 결과적으로 사용, 응용 분야 및 분석 품질에 영향을 미칩니다.

일반적으로 플라스틱 실험기구에 가장 많이 사용되는 재료는 폴리스티렌입니다. 폴리스티렌은 투명하기 때문에 광학 검출, 흡광도 분석(예: ELISA) 및 적당한 변형이 있는 현미경 검사에 이상적입니다. 그러나 폴리스티렌은 자외선(320nm 미만)을 투과하지 않으므로 RNA 및 DNA 정량화에는 부적합합니다. 이를 위해 시클리콜레핀 공중합체(COC)는 200~400nm 범위에서 자외선 투과율이 향상되고 자가 형광이 낮습니다(그림 4).광학 및 현미경 애플리케이션과 고함량 스크리닝의 경우 유리와 석영은 투명성, 자가 형광 및 빛 투과에 가장 적합한 소재입니다. 그러나 이러한 재료는 매우 비싸고 깨지기 쉬우며 일반적으로 일회용이 아닙니다.

광학 특성 외에도 수분 흡수와 가스 교환은 셀 기반 애플리케이션에서 중요한 역할을 합니다. 또한 기계적 특성은 특히 자동화된 시스템에서 취급에 영향을 미칩니다. 열적 특성은 고온 애플리케이션(예: PCR 플레이트)이나 실러가 필요할 때 중요한 역할을 할 수 있습니다.

폴리카보네이트와 폴리프로필렌은 주로 PCR 플레이트(그림 5)와 온도 변화가 큰 시료(예: -80°C 보관)에 사용됩니다. 온도 안정성 외에도 다양한 용제에 대한 내성 및 생물학적 불활성이 보관 목적으로 필요합니다.

색상

마이크로 플레이트는 일반적으로 투명, 검정, 흰색, 회색의 네 가지 색상으로 제공됩니다(그림 6). 사용된 감지 모드에 따라 색상은 매우 밝고 어두운 샘플이 인접할 때 신호 대 배경 비율과 우물 간 누화에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 최적이 아닌 색상을 선택하면 데이터에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

이 검출 모드에서는 빛이 시료를 통과해야 하므로 흡광도 분석에는 투명(UV 투명 포함) 마이크로 플레이트가 필요합니다.
검은색 마이크로플레이트(탄소로 인해 어두워진)는 시료의 신호를 부분적으로 소멸시킵니다. 이는 검은색이 시료에서 나오는 빛 신호를 부분적으로 흡수하기 때문에 발생합니다. 따라서 이 플레이트는 FRET을 포함한 형광 강도 및 형광 편광 분석에 적합합니다. 일반적으로 신호 수율이 높은 검출 모드이며 검정색을 사용하면 배경, 자동 형광 및 웰 간 혼선을 줄여 신호 대 블랭크 비율을 개선하는 데 도움이 됩니다.

검정색 마이크로 플레이트는 일반적으로 발광, 시간 분해 형광(TRF) 및 TR-FRET 분석에 권장되지 않습니다. 이러한 검출 모드는 일반적으로 검정색으로 인해 상대적으로 낮은 신호 수율을 갖기 때문입니다. 이러한 분석에는 이산화티타늄이 포함된 흰색 플레이트가 권장됩니다. 웰의 흰색은 샘플 신호를 부분적으로 반사하여 신호를 극대화하는 데 도움이 됩니다. 단점은 흰색 마이크로 플레이트는 블랭크 신호도 증가시킨다는 것입니다. 그러나 이는 일반적으로 발광 분석에서 매우 낮은 수준입니다. TRF에서는 지연된 측정 창이 배경의 영향을 제거합니다.

검정과 흰색의 중간 솔루션은 회색 마이크로플레이트입니다. 이 마이크로플레이트는 혼신과 배경을 줄이면서도 양호한 신호를 제공하기 때문에 특히 AlphaScreen^® 및 AlphaLISA^®에 권장됩니다.

다양한 검출 모드에서 플레이트 색상이 측정 결과에 미치는 영향에 대한 자세한 내용과 그 효과를 입증하는 데이터를 보려면 HowTo 참고 6: 내 분석에 가장 적합한 마이크로 플레이트 색상을 선택하는 방법을 참조하세요.

마이크로플레이트 웰 모양

웰은 원형 또는 정사각형일 수 있으며, 후자는 모서리가 직선 또는 둥근 형태입니다. 정사각형 웰은 원형 웰에 비해 샘플 부피가 더 크고 빛 투과 면적이 더 넓습니다. 원형 웰은 전체 면적이 더 작고 흔들기에 더 적합합니다. 또한 원형 웰은 일반적으로 인접한 웰과 공통 벽을 공유하지 않기 때문에 웰의 플라스틱 벽을 통한 신호 누화의 영향을 사각형 웰보다 덜 받습니다.

마이크로 플레이트 웰 바닥

우물 바닥도 다양한 모양으로 제공됩니다: F-, V-, U- 및 C- 바닥(그림 7). F-바닥(평평한) 웰은 빛 투과율이 가장 우수하고 부착성 세포 배양에 이상적이며 플레이트 판독기 또는 현미경을 사용한 바닥 판독 분석에 적합합니다.

V-바닥(원추형) 웰은 모양 때문에 작고 귀중한 시료의 부피를 최대한 회수할 수 있습니다. 그러나 원추형은 분광광도계 또는 이미징 애플리케이션에는 불리한 단점이 있습니다. 따라서 주로 샘플 보관 및 정밀한 피펫팅을 위해 V자형 웰이 사용됩니다.
둥근 웰 바닥(U-바텀)은 혼합, 세척 및 코팅을 용이하게 합니다. U-바닥 웰은 잔여물이 남지 않는 간편한 피펫팅을 가능하게 하며 일반적으로 현탁액 및 구상체 세포에 사용됩니다.

곡선형 바닥(C-바닥) 웰은 F-바닥 웰과 U-바닥 웰의 절충안입니다. 바닥이 평평하여 광학 측정에 적합하고 모서리가 둥글어 혼합과 세척이 용이합니다.

웰 코팅

웰의 표면 특성은 중요한 역할을 합니다. 여기서 시료와 웰 재료가 서로 상호작용합니다. 일반적으로 비결합 또는 저결합, 중간결합, 고결합의 세 가지 주요 유형의 마이크로플레이트가 제공됩니다. 결합력은 재료의 물리적 특성에 영향을 받으며 다양한 코팅을 적용하여 변경할 수 있습니다.

생화학 분광학 및 고처리량 스크리닝 애플리케이션의 경우 일반적으로 코팅이 없는 폴리스티렌이 선택되는 재료이며 중간 결합으로 분류됩니다.

비결합성 플레이트는 핵산, 단백질 및 펩타이드가 웰 표면에 결합하는 것을 방지합니다. 여기서 특정 코팅은 분석 배경을 감소시키고 신호 대 잡음을 개선합니다.

고결합 마이크로플레이트는 일반적으로 분자를 웰 표면에 고정해야 하는 분석에 사용됩니다. 가장 잘 알려진 용도 중 하나는 ELISA 분석입니다. 여기서 특정 코팅과 처리는 생체 분자(예: 항체)의 수동 흡착을 촉진하기 위해 정해진 수의 친수성 그룹을 도입합니다. 중결합 및 고결합 플레이트는 일반적으로 사용 가능한 극성기의 수가 다릅니다.

비결합, 중간 결합, 고결합 플레이트를 사용한 프로테아좀 활성 테스트를 통해 플레이트 코팅이 생물학적 데이터에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 한 가지 예를 보여주었습니다. 이 연구에서 연구진은 다양한 결과를 얻었으며 프로테아좀 분석의 성능이 마이크로 플레이트의 특성에 의해 영향을 받는다는 것을 보여주었습니다. 프로테아좀 활성은 이러한 목적으로 널리 사용되는 형광 프로테아좀 기질인 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC)을 사용하여 측정했습니다. 결합 및 비결합 AMC의 여기 및 방출 스펙트럼이 다르기 때문에 형광 플레이트 판독기로 단백질 분해 절단에 의해 방출된 유리 AMC를 쉽게 검출할 수 있었습니다. 그러나 유리 AMC의 표준 곡선은 세 가지 플레이트 유형 간에 상당한 차이를 보였습니다. 예상대로 결합력이 높은 플레이트가 가장 낮은 신호를 보였습니다. 따라서 다양한 마이크로플레이트를 평가하여 분석에 가장 적합한 플레이트와 가능한 플레이트별 효과의 역할을 결정해야 합니다^.4

또한 다른 플레이트 코팅은 액체 표면의 메니스시 형성에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 이는 방법 참고: 마이크로 플레이트의 경로 길이 및 메니스시 처리 방법에 설명된 대로 경로 길이 변경으로 인해 흡광도 기반 측정에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.

세포 기반 분석

일반 플레이트는 일반적으로 비멸균 상태이므로 세포 배양 및 세포 기반 분석에 사용할 수 없습니다. 멸균 외에도 웰 바닥에 세포가 쉽게 부착되도록 하기 위해 특정 친수성 표면 처리가 필요합니다. 이러한 친수성 처리는 일반적으로 "조직 배양 처리" 또는 TC 처리라고 합니다. 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌과 같은 세포 외 기질 단백질을 기반으로 한 코팅과 폴리라이신과 같은 합성 코팅도 있습니다. 세포 표면은 일반적으로 현탁 세포, 오가노이드 및 스페로이드에 필요합니다.

세포 분석은 때때로 몇 시간 또는 며칠에 걸쳐 평가되기 때문에 세포가 들어 있는 웰에서 증발하면 결과에 영향을 미치고 궁극적으로 세포 생존력이 감소할 수 있습니다. 일부 제조업체에서는 액체로 채울 수 있는 외부 해자를 포함한 플레이트를 제공합니다. 이는 웰을 단열하는 데 도움이 되며, 특히 증발 위험이 있는 가장자리 웰에서 증발을 방지하는 데 도움이 됩니다.

세포 기반 분석을 실행할 때는 일반적으로 여러 가지 이유로 웰의 바닥에서 검출하는 것이 좋습니다. 일반 흰색 또는 검은색 플레이트에서는 웰 바닥에서 판독할 수 없으므로 투명한 바닥을 사용해야 합니다. 우물 벽은 분석에 따라 흰색 또는 검은색이 될 수 있습니다. 투명한 바닥은 플라스틱(폴리스티렌 또는 시클리콜레핀 공중합체)에서 유리 또는 석영까지 다양한 재질로 만들 수 있습니다. 플라스틱에 비해 유리와 석영의 검출 성능이 훨씬 뛰어나지만, 유리와 석영은 가격이 훨씬 더 비쌉니다. 또한 유리와 석영 플레이트는 일회용이 아니므로 사용 후 매번 세척하고 고압 멸균 처리해야 합니다. 따라서 투명한 플라스틱 바닥의 저렴하고 사용하기 쉬운 일회용 마이크로 플레이트에 비해 더 높은 비용과 더 많은 유지 관리가 필요한 더 나은 성능이 이러한 플레이트의 사용을 정당화할 수 있는지 결정해야 합니다.

마이크로 플레이트 리더에서 사용

마이크로플레이트판독기는 마이크로플레이트 기반 분석에서 액체 샘플에서 생성되는 빛 신호를 감지하고 정량화합니다. 이 실험실 기기는 생명 과학 및 제약 산업에서 화학, 생물 또는 물리적 반응을 정량화하는 데 사용됩니다. 마이크로플레이트 리더는 생물학, 세포, 생화학, 제약 및 신약 개발 분야 외에도 환경 연구, 식품 또는 화장품 산업에서도 사용됩니다.

마이크로 플레이트 리더기는 흡광도, 형광 강도, 발광, 시간 분해 형광과 같은 다양한 모드로 시료를 정량화할 수 있는 단일 또는 다중 모드 기기로 제공됩니다, TR-FRET, 형광 편광 및 알파스크린. 파장 선택 방식에 따라 모노크로메이터 또는 필터 기반 플레이트 리더기를 사용할 수 있습니다.

일반적으로 이러한 장비를 사용하면 실험실 업무의 효율성이 향상되고 시약 비용을 절감하고 작업 시간을 단축하는 데 도움이 됩니다. 오늘날 마이크로 플레이트 리더기가 어떻게 사용되는지에 대한 개요를 보려면 애플리케이션 노트 데이터베이스를 살펴보시기 바랍니다.

ANSI/SLAS 표준에도 불구하고 제조업체마다 플레이트의 치수와 웰 위치가 약간씩 다릅니다. 이는 측정된 데이터에 영향을 미칠 수 있습니다. 24개 또는 48개의 웰(각각 384개 및 1536개 웰 플레이트의 경우)이 있는 라인에서 웰 위치의 깊이 또는 폭이 조금만 오프셋되어도 웰 중앙에서 측정이 이루어지지 않고 최악의 경우 두 샘플 사이의 플라스틱 벽에서 측정이 이루어질 수 있습니다.

따라서 BMG LABTECH 리더기에는 여러 제조업체의 50개 이상의 다양한 플레이트 레이아웃이 포함된 마이크로 플레이트 선택 데이터베이스가 함께 제공됩니다.

자동화된 처리

마이크로플레이트 판독기 외에도 마이크로플레이트를 처리하거나 관리하는 다른 다양한 기기가 있습니다. 이러한 기기는 특히 실험실 자동화에 사용됩니다. 몇 가지 예로는 여러 플레이트에서 액체를 분배하거나 제거하는 데 사용되는 액체 핸들러와 와셔, 기기 간에 플레이트를 운반하는 로봇 팔과 컨베이어 벨트, 단기간 보관하는 플레이트 스태커, 장기 보관용 플레이트 호텔 또는 인큐베이터 등이 있습니다. 또한 플레이트 실러와 디실러는 실링 포일을 부착하고 제거합니다. 자동화된 처리의 예는 다음 동영상에서 확인할 수 있습니다: