형광 편광

형광 편광 감지의 이론

형광 편광 감지는 형광 강도 페이지에서 찾을 수 있는 정상 상태 형광 감지의 일반 이론을 기반으로 합니다. 또한 형광체의 편광 정도가 텀블링 속도와 반비례한다는 사실과 형광체가 방출하는 빛이 일반적으로 여기 평면에 수직 및 평행한 다른 편광 평면에서 다른 강도를 가질 수 있다는 관찰에 의존하여 검출합니다.

평면 편광된 빛이 작은(일반적으로 1.5 kDa 미만) 결합되지 않은 형광 분자(추적자)를 여기시키면 주로 편광되지 않은 빛을 방출합니다. 이는 여기와 방출 사이의 시간 동안 작은 자유 분자가 용액에서 빠르게 회전하고 이에 따라 다른 편광 평면에서 빛을 방출(비편광)하기 때문입니다.

반대로 작은 형광 분자가 더 큰 형광 분자(일반적으로 >10 kDa)에 결합하면 분자 부피가 증가하여 회전 속도가 느려지고 여기 소스와 같은 평면에서 편광된 빛을 방출하게 됩니다(그림 2).

형광 편광의 정량화

따라서 형광 편광은 여기와 추적자의 방출 사이의 시간 동안 발생하는 분자 회전의 양을 측정한 것입니다. 다음 공식으로 계산됩니다:

p = (f|| - f⊥)/(f|| + f⊥)

정량적으로는 여기 광면에 평행한(F||) 방출 형광 강도와 수직인(F⊥) 방출 형광 강도의 차이를 총 형광 방출 강도로 나눈 값으로 정의됩니다^.

값 P는 빛의 세기의 비율이므로 치수가 없는 숫자입니다. 흔히 밀리분극(mP)으로 표현되며, 1 P = 1000 mP입니다. P는 -330~500mP 범위의 값을 가지지만, 이론적 한계에 도달하는 경우는 거의 없습니다. 바이오 분석 애플리케이션에서 일반적인 데이터 범위는 10~300mP입니다(예: 그림 3).

형광 편광 및 이방성

이방성이란 용어는 1960년에 도입되었으며 편광 방출의 맥락에서 자주 사용됩니다. 이방성(A 또는 r로 지정)은 아래 방정식에서 방출 강도의 비율입니다:

r = (F|| - F⊥)/(F|| + 2 F⊥)

F||는 방출광에 수직 편광 여기 및 수직 편광 후의 강도를 나타냅니다. F⊥는 여기에는 수직 편광판을, 방출에는 수평 편광판을 사용했을 때의 강도를 나타냅니다.

형광 편광과 이방성은 수학적으로 서로 연관되어 있으며 같은 의미로 사용됩니다. 둘 다 편광 및 비편광 빛의 방출 강도에서 파생되며 형광 분자의 결합/비결합 상태의 평균을 나타냅니다. 이방성은 추가 정보를 제공하지 않기 때문에 대부분의 애플리케이션에서 두 함수의 정보 내용은 동일합니다^.

일반적으로 한 용어 또는 다른 용어를 선택하는 것은 실용적인 고려 사항과 습관에 따라 달라집니다. 형광 편광은 전체 기술 및 임상 화학에서 가장 자주 사용되는 반면 이방성은 생물 물리학 및생화학에서 더 일반적으로 사용됩니다.

형광 편광은 어떻게 감지하나요?

형광 편광은 마이크로 플레이트 판독기에서 감지할 수 있으며 형광 강도와 동일한 절차 및 설정에 의존합니다. 그러나 주로 편광 평면의 선택과 관련된 몇 가지 차이점이 있습니다.

샘플은 수직(평행) 편광에 의해 특정 파장에서 여기됩니다. 여기 광원은 일반적으로 크세논 또는 할로겐 램프입니다. 백색광은 필터 또는 모노크로메이터를 사용하여 스펙트럼 필터링됩니다. 편광면은 편광판이라고 하는 특정 필터에 의해 선택됩니다.

자연광의 전기장 벡터는 전파 방향에 대한 모든 진동 방향을 가정할 수 있습니다. 편광판은 일반적으로 얇은 필름인 광학 요소로, 전기 벡터의 한 방향을 분리할 수 있습니다. 여기 편광판은 여기 소스와 샘플 사이에 위치합니다. 수직면의 상대적인 방향은 시료에 평행한 빛을 투과시키고 수직 편광은 차단합니다.

시료에서 방출된 빛은 필터 또는 모노크로메이터로 분광 필터링되어 원하지 않는 파장을 제거합니다. 또한 방출된 빛은 편광 여기 광의 평면에 대한 방향에 따라 평행 또는 수직 파동으로 분리되어야 합니다. 이는 시료와 검출기 사이의 광 경로에 위치한 여기 편광판과 동일한 유형의 전형적인 방출 편광판에 의해 가능합니다. 마지막으로, 두 편광면의 강도는 검출기(일반적으로 광증배기 튜브(PMT))에 의해 정량화됩니다.

두 평면은 개별적으로 감지됩니다. 가장 간단한 방법은 두 개의 순차적인 측정으로 평행면과 수직면을 감지하는 것입니다. 첫 번째 측정에서 평행 편광 강도가 감지된 후 90° 회전된 방출 편광판을 사용하여 수평(수직) 평면을 감지합니다(그림 4).

PHERAstarFSX와 같은고급형 형광 편광 판독 장비는동시 이중 방출 감지 기술 덕분에 두 편광면을 동시에 획득할 수 있습니다. 이 접근 방식은 시간을 절약하고 두 번의 순차적 측정으로 인해 발생하는 변동성을 줄여줍니다.

형광 편광 감지에 대한 고려 사항

일반적으로 모노크로메이터는 본질적으로 빛의 투과율이 낮고 배경(미광)이 높기 때문에 FP 검출에 권장되지 않습니다. 이러한 요소는 시료 변동성을 증가시켜 분석 창과 견고성에 부정적인 영향을 미칩니다.

UV 범위에서 검출하려면 리더기에 제논 램프를 장착해야 합니다. 할로겐 램프는 400nm 이하에서 방출이 좋지 않기 때문에 권장되지 않습니다. 또한 일반 편광판은 자외선 파장의 투과율이 낮기 때문에 특정 자외선 편광판이 필요합니다.

낮은 수준의 편광(P)은 형광 분자가 용액에서 자유롭게 결합하고 이동하지 못했음을 나타냅니다. 높은 P 수준은 더 큰 분자 복합체가 존재함을 나타냅니다. 바이오 분석 분야의 측정 범위는 10~300mP로 상당히 제한적일 수 있지만 PHERAstar FSX 또는CLARIOstarPlus와 같은 고급 다중 모드 마이크로 플레이트 리더기를 사용하면 표준 편차 ± 0.5mP의 매우 정밀한 측정을 수행할 수 있습니다.

형광 편광 분석용 형광 발색제

FP 분석에서 형광 염료의 선택은 매우 중요합니다. 여기 및 발광 스펙트럼은 용액에 존재하는 다른 분자의 파장과 달라야 자가 형광을 줄일 수 있으며, 빛 산란의 부정적인 영향을 줄이기 위해 큰 스토크스 편이를 가져야 합니다. 형광 발색단은 추적자에 쉽게 접합되어야 하지만 추적자의 텀블링을 방해하거나 상호 작용을 방해해서는 안 됩니다. 또한 양자 수율(즉, 높은 강도)이 높아야 하며 화학적으로 안정적이고 광안정성이 있어야 합니다^.4

가장 일반적으로 사용되는 형광체는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)와 유사한 스펙트럼을 가진 염료입니다. 그러나 최근에는 최신 마이크로 플레이트 리더기의 성능 향상에 힘입어 Cy3B 및 Cy5와 같은 적색 염료가 인기를 얻고 있습니다. 신호 감지의 기술적 개선으로 인해 본질적으로 낮은 광자 수율이 더 이상 한계가 되지 않기 때문에 녹색과 파란색 범위에서 일반적으로 방출되는 자가 형광으로 인한 위음성 및 빛 산란 이벤트로 인한 위양성을 줄이는 데 유리할 수 있습니다.⁵

형광 편광의 장점

분자 결합 이벤트를 연구하는 데 사용되는 접근법 중 FP는 독특합니다. 단일 형광 표지 전략을 기반으로 하기 때문에 추가적인 분리 단계가 필요하지 않습니다. 따라서 기존 방법에 비해 더 적은 수의 시약과 일반적으로 더 저렴한 시약을 사용할 수 있습니다. 또한 시료 무결성에 영향을 받지 않으므로 pH, 온도, 점도가 일정하다면 시료를 반복적으로 측정할 수 있는 경우가 많습니다.

FP를 사용하면 용액 내 추적자의 유리/결합 비율을 실시간으로 직접 모니터링할 수 있으므로 매우 낮은 농도(일반적으로 피코몰 범위까지)로도 평형 분석이 가능합니다. 그러나 실시간 특성으로 인해 실험이 평형에 국한되지 않고 결합/해리 동역학도 쉽게 분석할 수 있습니다.

FP는 간단한 믹스 앤 리드 프로토콜을 사용하는 균질 기법으로, 결합 종과 유리 종을 분리하여 측정할 필요가 없습니다. 균질 분석은 결합 반응이 추가 단계에 의해 방해받지 않기 때문에 결합 이벤트의 보다 정확한 정량화를 제공합니다. 그러나 FRET,TR-FRET 또는AlphaScreen^®과 같은 다른 동종 분석법은 추적자의 단일 표지 외에 추가 표지 반응이 필요하다는점에 유의해야 합니다.

또한 FP의 비율 측정적 특성은 화합물 흡광도 또는 담금질이 데이터 수집에 미칠 수 있는 부정적인 영향을 없애고 소형화를 가능하게 합니다. 이러한 모든 이유로 인해대량 처리량 스크리닝에 FP 분석법이 채택되었습니다.

형광 편광의 한계

모든 장점에도 불구하고 이 측정 시스템에는 몇 가지 한계가 있습니다. FP는 최대 신호와 분석 창을 생성하기 위해 분자량의 큰 변화가 필요합니다. 형광 편광 결합 분석은 기껏해야 작은 분자와 큰 분자 사이의 상호작용을 모니터링할 수 있으며, 형광 발색단과 가장 작은 상호작용 파트너의 라벨링이 필요합니다. 따라서 추적자는 일반적으로 작은 단백질이나 펩타이드, 사이토카인 및 화합물입니다. 이는 일반적으로 결합 시 가능한 가장 큰 분자량 차이를 보장하므로 가능한 가장 큰 분석 창을 보장합니다. FP 결합 분석은 두 개의 큰 단백질의 상호작용을 관찰하는 데는 적합하지 않습니다.

또한 화합물 자가 형광 및 빛 산란으로 인해 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 따라서 일반적으로 형광 염료를 추가하기 전에 웰의 형광 배경을 정량화하여 계산에서 빼는 것이 좋습니다. 자가 형광은 일반적으로 더 높은 파장에서 덜 두드러지므로 BODIPY TMR 또는 Cy5 염료와 같은 적색 염료를 사용하면 배경 노이즈를 최소화할 수 있습니다.^{6, 7}

애플리케이션: 형광 편광 결합 분석

FP 결합 분석은단백질-리간드 또는펩타이드-단백질 상호작용,단백질-DNA 상호작용,프리피브릴 단백질 응집에서 분자 상호작용 또는 해리 현상을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 간섭 화합물 및 비특이적 억제제를 식별하는 데에도 사용할 수 있습니다.

다른 응용 분야로는리포솜과 미토콘드리아 막의막 유동성 분석, 단백질 분해,RNA 합성, 결합 동역학 및 유비퀴틴접합/해체와 같은 효소 분석이실시간으로 포함됩니다(그림 5). 유비퀴틴에 대한 실시간 애플리케이션은 예를 들어 표적에 대한 결합 활성 및 상호 작용의 동역학 연구를 포함하여 단백질 분해 T아르제팅 키메라(PROTAC) 또는 분자 접착제의 표적 단백질 분해에 사용할 수 있습니다. FP 결합 분석은 알려진 디그론과 리가제 간의 특정 상호작용으로 인해 발생하는 표적 단백질 분해를 살펴보는 데에도 사용할 수 있습니다.

저분자 스크리닝에서의 형광 편광 분석

90년대에 약물 스크리닝 환경에서는 약물 발견 과정을 용이하게 하기 위해 FP가 채택되었습니다. 오늘날에는 균일하고 빠르며 정량적인 포맷으로 인해 스크리닝 시설에서 일상적으로 사용됩니다. FP는 결합/자유 추적자의 비율에 선형적으로 비례하는 경우가 많기 때문에 약물 후보의 _IC50 값을결정하는 데 자주 사용됩니다.

신약 개발에서는 GPCR, 키나아제, 포스파타제, 프로테아제와 같은 다양한 표적을 연구하는 데 사용되었습니다. 상호 작용 연구에서 FP는 일반적으로 분자량의 증가를 감지하지만, 해리 및 효소 분해 분석에서는 일반적으로 분자량의 감소를 판독 값으로 사용합니다.

HTS에서 형광 편광 분석의 주요 응용 분야는 효소 반응뿐만 아니라 직접적인 분자 상호 작용 분석입니다. 여기서 빠르고 민감한 마이크로플레이트 판독기를 사용하면 점점 더 다양한 표적 클래스에 대한 저분자 분자를 효율적으로 스크리닝할 수 있습니다. 예를 들어유비퀴틴화 조절제 및 항암 표적 CSN5의 억제제 스크리닝과H-프로스타글란딘 D 신타제 억제제 스크리닝이 포함됩니다.

호모FRET 형광 편광

포스터 공명 에너지 전달(FRET)은 상호 작용 이벤트를 연구하는 일반적인 방법입니다. 일반적으로 두 개의 추정 상호 작용 파트너는 두 개의 서로 다른 형광체(공여체와 수용체)로 표지됩니다. 그러나 FRET은 같은 형광체(호모FRET) 사이에서도 일어날 수 있습니다. 에너지 전달이 방출 편광의 무작위화를 유발하여 탈분극 신호를 생성하기 때문에 FP를 호모FRET에 적용할 수 있습니다. 호모FRET-FP는 애플리케이션 노트 "호모FRET-FP 검출을 이용한 살아있는 세포의 인슐린 과립 포장 모니터링"에 설명된 대로 세포 내 단백질 축적 또는 이량체화 이벤트를 연구하는 데 사용할 수 있습니다(그림 6).

형광 편광 면역 분석

형광 편광 면역 분석법(FPIA)은 생화학 분야에서 최초로 적용되었습니다. 이는 항원 또는 항체를 검출하는 데 사용되는 경쟁적인 생화학 분석법입니다. 형광 편광 면역 분석에서는 형광 발색단에 결합된 항원이 추적자로 사용됩니다. 이 항원과 두 번째 항원은 일반적으로 선택된 항체와 결합하기 위해 경쟁합니다. 추적자와 항체의 결합이 높으면 일반적으로 편광 신호가 발생하는 반면, 표지되지 않은 항원이 항체에 많이 결합하면 유리 추적자는 편광이 아닌 빛을 생성합니다. 이러한 변화는 시료에 존재하는 항원의 양에 비례합니다^.8

참조

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2. 자블론스키 A. 1960. 방출 이방성의 개념에 대하여. Bull l' Acad Pol Sci, Ser A 8:259-264.
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4. 장, H.; 양, S.; 드 뤼크, K.; 벨로글라조바, N.V.; 에레민, S.A.; 드 사거, S.; 장, S.; 셴, J.; 왕, Z. 식품 및 환경 분석에서 화학 오염물질에 대한 형광 편광 분석. TrAC Trends Anal. Chem. 2019, 114, 293-313.
5. Turek-Etienne TC, Small EC, Soh SC, Xin TA, Gaitonde PV, Barrabee EB 등: 4개의 형광 포라라이제이션 분석에서 형광 화합물 간섭 평가: 2개의 키나아제, 1개의 프로테아제, 1개의 포스파타제. J Biomol Screen. 2003;8:176-184.
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8. 인간 혈청 및 혈장에서 유리 미코페놀산 측정을 위한 민감한 신속 형광 편광 면역 분석법. 베티나 글란-마르티네즈, 엘레나 베니토-페냐, 프란체스카 살리스, 아나 B. 데스칼조, 기예르모 오렐라나, 마리아 C. 모레노-본디 분석 화학 2018 90 (8), 5459-5465.