알파스크린

알파플렉스는 서로 다른 파장에서 방출하는 서로 다른 억셉터 비드를 사용하여 단일 웰에서 최대 3개의 분석물을 정량화할 수 있는 추가 개발 제품입니다. 이 비드에서 안트라센과 루브렌은 테르븀 킬레이트(AlphaPlex 545의 경우) 또는 사마륨 킬레이트(AlphaPlex 645의 경우)로 치환됩니다. 비오티닐화된 항-분석물질 항체는 스트렙타비딘 도너 비드와 결합합니다. 해당 항-분석물 항체는 AlphaPlex 또는 AlphaLISA 수용체 비드에 접합됩니다. 표적 분석물이 있는 경우, 도너 비드의 여기와 그에 따른 단일 산소 방출은 다른 수용체 비드에서 화학 발광을 유발합니다.

각 유형의 비드는 서로 다른 파장에서 빛을 방출합니다. 알파리사 비드의 경우 615nm 외에 다른 방출 피크는 테르븀 비드의 경우 545nm, 사마륨 비드의 경우 645nm에 있습니다(그림 5). 따라서 한 번의 분석에 AlphaLISA, AlphaPlex 545 및 AlphaPlex 645 수용체 비드를 사용하여 트리플플렉스 분석을 개발할 수 있습니다^.2

알파스크린은 어떻게 검출하나요?

AlphaScreen 화학 측정은 주로마이크로 플레이트 판독기에서 수행됩니다. 독립적인 판독 모드이므로 분석 검출을 위해서는 AlphaScreen 검출 모드가 있는 마이크로플레이트 판독기가 필요합니다. 여기에는 AlphaLISA 및 AlphaPlex에 대한 검출 기능도 포함됩니다. 이 기술은 처리량이 많은 약물 스크리닝에 자주 사용되므로 플레이트 리더기는 384 및 1536 웰 플레이트와 호환되어야 합니다.

알파스크린 플레이트 리더의 기본 설정은 광원, 파장 선택을 위한 여기 및 방출 필터, 광증배관(PMT) 검출기로 구성됩니다.

광원: 크세논 램프 또는 레이저

도너 비드의 감광제는 680nm에서 특별히 여기되므로 광원으로 제논 플래시 램프 또는 특정 여기 레이저가 사용됩니다. 전용AlphaScreen 레이저는 680nm에서 더 많은 에너지를 집중시켜 제논 램프보다 성능이 뛰어나며 더 넓은 동적 범위와 향상된 신호 대 잡음비로 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.

전용 알파스크린 여기 레이저는 일반적으로 하이엔드 및 PHERAstarFSX 및 CLARIOstarPlus와 같은 HTS 전용 멀티 모드 마이크로 플레이트 리더기에서 사용할 수 있습니다. 저가형 리더기에는 일반적으로 알파스크린 감지를 위한 제논 플래시 램프가 장착되어 있습니다.

알파플렉스는 다양한 방출 파장의 감지를 수반합니다. 순차적으로 측정할 수 있지만, 두 가지 방출을 동시에 감지하면 특히 스크리닝 분석에서 데이터 품질과 속도 이점을 모두 보장할 수 있습니다. 따라서동시 이중 방출 감지는이중 방출 AlphaLISA-AlphaPlex 분석에서 처리량을 높이는 데 도움이 됩니다.

크로스토크 감소

크로스토크는 검출기에 의해 특별히 측정되지 않고 측정 웰의 신호에 부정적인 영향을 미치는 측정 웰을 제외한 모든 웰에서 나오는 빛입니다 .

알파스크린 반응에 의해 웰에서 생성된 빛은 확산되기 때문에 다른 웰을 측정하더라도 인접한 웰과 감지 부위로 직접 확산될 수 있습니다. 이로 인해 신호가 편향되고 신호 변동이 커지며 전반적인 감도가 낮아집니다.

원하지 않는 광 신호는 플레이트 위 또는 유정 벽을 통해 감지기에 도달하므로 다르게 처리해야 합니다(그림 6).

• 물리적 차단: 구멍이 뚫린 검은색 숟가락 모양의 액세서리입니다. 특정 웰에 배치하면 인접한 웰에서 쏟아져 들어오는 원치 않는 빛을 물리적으로 차단합니다(그림 6). 구멍을 통해 관심 우물의 빛은 감지기에 도달하고 주변에서 들어오는 빛은 물리적으로 차단됩니다.

• 수학적 누화 감소: 흰색 불투명 마이크로 플레이트에서도 우물의 플라스틱 벽을 통해 빛이 투과할 수 있습니다. 고밀도 플레이트(예: 1536 웰)는 웰이 가깝고 벽이 얇기 때문에 빛 누출에 더 취약합니다. 또한 인접한 정사각형 웰은 벽을 공유하기 때문에 원형 웰보다 벽면 통과 누화가 더 높습니다. 또한, 플레이트의 색상은 마이크로 플레이트 벽을 통한 크로스토크에 영향을 미치며, 플레이트가 어두울수록 크로스토크가 낮아집니다. 플레이트를 더 최적화할 수 없는 경우, 수집된 데이터에 수학적 크로스토크 감소를 적용할 수 있습니다. 이를 위해 인접 웰에 대한 신호의 블리드스루를 결정하고 알고리즘이 발광 데이터를 보정합니다.

두 가지 누화 감소 툴은 모두 비엠지랩텍의 플레이트 리더기 PHERAstar FSX 및 CLARIOstar Plus에서 사용할 수 있습니다.

알파스크린 번호판 리더기

AlphaScreen/AlphaLISA 검출은 PHERAstar FSX 및 CLARIOstarPlus에서 수행할 수 있습니다. 고강도 여기 소스는 분석에 도움이 되므로, CLARIOstar 및 PHERAstarFSX에는 680nm에서 고강도 빛을 생성하는 전용 고체 레이저가 있습니다. 또한 PHERAstarFSX는 두 개의 알파 신호를 동시에 측정할 수 있는 특정 AlphaPlex 광학 모듈을 제공합니다 .

알파스크린 기술의 장점

알파스크린은 고처리량 스크리닝 애플리케이션에 특히 적합한 균일하고 민감하며 다운스케일링이 가능한 플랫폼을 제공합니다.

높은 신호 대 배경 비율

신호 생성 프로세스는 높은 신호 증폭을 생성하는 캐스케이드 반응입니다. 따라서 감도가 높습니다. 또한 배경이 낮습니다. 이는 주로 여기 파장이 빨간색 범위에 있고 방출 신호보다 높은 파장에 있기 때문입니다. 이는 일반적으로 청록색 범위에서 여기되는 생체 분자 성분에 의해 생성되는 자동 형광을 감소시킵니다. 또한 여기와 방출 사이의 시간 지연은 자동 형광 노이즈를 더욱 제거합니다.

균질 분석

결합된 도너-억셉터 비드 복합체의 검출은 배경을 줄이기 위해 결합되지 않은 구성 요소와 물리적으로 분리할 필요가 없는 균질한 화학 반응입니다. 따라서 중간 분리 또는 세척 단계가 필요하지 않으며 간단한 추가 및 판독 프로토콜로 실행할 수 있습니다. 따라서 처리 단계를 최소화하고 다른 방법보다 더 편리하고 시간도 적게 소요됩니다. 따라서 자동화 지원 검사에 특히 적합합니다. 이것이신약 개발 및 HTS에서 많이 채택되는 이유 중 하나입니다.

다운스케일링 및 소형화

감도가 높고 배경이 낮기 때문에 AlphaScreen은 1536웰 플레이트에 쉽게 적용할 수 있으며 애플리케이션 노트 "세포 기반 TNF-α AlphaLISA 분석의 소형화"에서 볼 수 있듯이 시약 농도나 분석 견고성의 변화 없이 수 µl로 쉽게 다운스케일링할 수 있습니다.

알파스크린 기술 검출의 함정

적절한 마이크로플레이트 및 취급

흰색 마이크로 플레이트는 빛 신호를 반사하므로 AlphaScreen 측정에 가장 적합합니다. 검은색 플레이트는 빛을 흡수하여 신호와 배경을 모두 감소시킵니다. 회색 플레이트는 크로스토크 감소와 신호 반사 사이에서 가장 좋은 절충안을 제공합니다. 플레이트 선택에 대한 자세한 정보는 블로그 게시물에서 확인할 수 있습니다:"마이크로 플레이트: 실제에서의 유용성."

흰색 플레이트는 고유한 인광성을 가지고 있기 때문에 햇빛이나 실내 조명에 노출되면 빛을 발산합니다. 이 비특이적 신호는 시료에서 방출되는 빛과 함께 판독기에 의해 측정되어 블랭크와 배경이 증가하고 분석 창이 줄어듭니다. 따라서 어두운 곳에서 흰색 플레이트를 준비하거나 측정하기 전에 약 15분 동안 어두운 곳에 두는 것이 좋습니다.

환경 조명

알파스크린 화학은 빛에 민감합니다. 가장 이상적인 것은 차분한 조명 조건(100 Lux 미만)에서 준비하고 실행하는 것입니다. 항상 가능한 것은 아니므로 밀폐된 공간에는 녹색 필터 조명을 설치해야 합니다. 작업 공간 및/또는 플레이트 리더기 바로 근처에 있는 조명기구는 녹색 필터로 덮어야 합니다. 녹색 필터를 사용하면 어둠 속에서 분석을 실행하는 것만큼이나 효과적인 것으로 나타났습니다(그림 7).

장시간 배양할 플레이트는 어두운 천, 알루미늄 호일 또는 판지 상자로 덮어 빛으로부터 보호해야 합니다. 마이크로플레이트 또는 플레이트 판독기를 직사광선이나 강한 빛에 노출시키지 마세요.

환경 온도

알파스크린 화학 물질은 온도에 민감합니다. 따라서 급격한 실내 온도 변화는 신호 생성, 강도 및 안정성에 부정적인 영향을 미치므로 피해야 합니다. 일반적으로 AlphaScreen 신호 변동은 °C당 약 8%입니다^.3

판독하는 동안 플레이트에서 신호 강도의 변화를 피하려면 시약과 마이크로플레이트도 실온과 평형을 유지해야 합니다. 플레이트의 경우THERMOstar 인큐베이터에서 인큐베이팅하면 쉽게 이를 달성할 수 있습니다. AAS 시스템이 장착된 PHERAstar FSX는 판독기를 18°C에서 45°C 사이의 모든 온도로 능동적으로 설정할 수 있어 기기의 배양 챔버를 실온 이하로 냉각할 수 있습니다. 이 애플리케이션 노트에서는 안정적인 온도 유지, 증발 감소 및 고온에서 저온으로의 냉각 시간을 줄이는 AAS 시스템의 능력을 보여 줍니다.

세포 배양 배지 및 혈청

RPMI 1640, MEM 및 DMEM과 같은 세포 배양 배지는 신호 강도에 부정적인 영향을 미칩니다. 10% 배양 배지가 있으면 약 30%의 신호가 소멸됩니다. 마찬가지로 10%의 태아 송아지 혈청은 신호를 약 25% 감소시킵니다^.3따라서 AlphaScreen 케미컬을 적용하기 전에 PBS와 같은 적절한 완충액으로 세포 샘플을 ^헹구는 것이 좋습니다.

알파스크린 분석

AlphaScreen 기술은 다양한 생물학적 환경에서 96, 384 및 1536 웰 플레이트 형식으로 결합 또는 생화학적 이벤트를 분석하는 데 적용할 수 있습니다. 이 기술은 특히 약물 스크리닝 커뮤니티에 널리 퍼져 있습니다.

AlphaScreen은 GPCR 기능 분석(cAMP, IP3 및 phospho-ERK1/2), 효소 분석(티로신 키나아제, 헬리케이즈, 프로테아제, 포스파타제), 상호작용 분석(사이토카인 결합 분석, 핵 수용체 기능 분석, 리간드 수용체 결합 분석, 단백질/단백질, 단백질/DNA,단백질/펩티드), ELISA 유사 면역 분석(TNF-α,IgG)과 같은 다양한 분석에 적용됩니다.

결합 분석: 단백질-펩타이드 상호 작용 및 억제제 식별

애플리케이션 노트 '인간 YEATS 도메인에 대한 선택적 억제제 개발을 위한 PHERAstar 측정 AlphaScreen 분석'에서는 AlphaScreen 기반 상호작용 분석의 예를 보여줍니다.

YEATS 도메인은 후성유전학적 조절인자입니다. YEATS를 포함하는 ENL은 여러 유형의 급성 백혈병의 주요 원인으로 확인되었습니다. 따라서 ENL은 신약 개발의 표적입니다. 선택적 억제제를 선별하기 위해 AlphaScreen 히스티딘 검출 키트를 사용하여 히스톤 3(H3) - YEATS 도메인 결합 분석법을 설정했습니다. 도너 비드는 스트렙타비딘을 통해 아실화된 H3에, 억셉터 비드는 YEATS 도메인에 결합됩니다. 단백질과 펩타이드가 상호 작용하면 서로 다른 비드가 결합하여 알파스크린 신호가 생성됩니다(그림 8). 억제제는 H3-YEATS 상호 작용을 방해하여 방출 신호를 감소시킵니다.

면역 분석: 포스포-ERK1/2 검출

상호 작용 외에도 면역 분석도 구현할 수 있습니다. 많은 GPCR에 대한 반응은 현재의 분석 형식으로는 쉽게 측정할 수 없습니다. ERK 인산화 캐스케이드는 유전자 전사를 조절하는 세포질 및 핵 단백질 모두의 인산화를 초래합니다. 따라서 GPCR 결합에 의해 유도된 세포 변화를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

이를 위해 세포 용해물에 알파스크린 ^{슈어파이어®} ERK1/2 인산화 분석법을 사용했습니다. 이것은 샌드위치 면역 분석법입니다. 인산화된 세포 단백질은 스트렙타비딘 코팅 도너 비드와 연결된 항-분석물 항체와 단백질 A-공액 수용체 비드와 연결된 항-포스포 항체 사이에 끼워져 있습니다(그림 9). 분석 물질의 인산화는 광 신호의 증가를 초래합니다. 이는 애플리케이션 노트An AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2 분석에 나와 있습니다.

참고 자료

1. 발광 산소 채널링 면역 분석: 화학발광을 통한 입자 결합 동역학 측정. Ullman, EF, et al. Natl. Acad. 미국, 91권, 5426-5430쪽, 1994년 6월.
2. 야스가르 A, 자다브 A, 시메오노프 A, 쿠센스 NP. 알파스크린 기반 분석: 까다로운 효소 및 단백질-단백질 상호 작용의 저분자 억제제에 대한 초고 처리량 스크리닝. 2016;1439:77-98. 도이:10.1007/978-1-4939-3673-1_5
3. https://www.urmc.rochester.edu/MediaLibraries/URMCMedia/hts/documents/AlphaScreenPracticalGuide.pdf

AlphaScreen, AlphaLISA, AlphaPlex 및 ^{SureFire®는} 퍼킨엘머의 등록 상표입니다.