AlphaScreen | BMG LABTECH

Qu'est-ce qu'AlphaScreen ?

AlphaScreen^® (ALPHA pour Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) est une technique basée sur des billes permettant d'étudier les interactions entre les molécules dans une microplaque. Développée à l'origine en tant que méthodologie pour les tests de diagnostic appelés LOCI^® (Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay) en 1994, la technologie AlphaScreen (ou technologie Alpha) comprend aujourd'hui AlphaScreen, AlphaLISA^® et AlphaPlex™. Elle est principalement utilisée dans le domaine des sciences de la vie pour le dépistage.

Le principe fondamental de cette technologie consiste à lier deux molécules d'intérêt différentes à des billes spécifiques. En cas d'interaction entre les deux molécules et de proximité des deux billes, un transfert d'énergie d'une bille à l'autre a lieu. Il en résulte la production d'un signal chimiluminescent. La technologie AlphaScreen est principalement utilisée dans les essais de criblage à haut débit pour évaluer les interactions biomoléculaires, la formation ou la déplétion d'un substrat ou d'un produit, les modifications post-traductionnelles, ainsi que pour quantifier les analytes.

Outre les essais d'interaction (ligand/récepteur, protéine/protéine, protéine/ADN), la technologie AlphaScreen peut également être utilisée pour les essais fonctionnels GPCR (détection du second messager), les essais enzymatiques et les essais immunologiques.

Technologie AlphaScreen

Les tests AlphaScreen sont basés sur deux types de billes recouvertes d'hydrogel : les billes donneuses et les billes acceptantes. Ces deux types de billes contiennent des produits chimiques différents qui sont essentiels à la génération du signal lumineux. La bille donneuse contient un photosensibilisateur qui, lorsqu'il est excité par la lumière à 680 nm, convertit l'oxygène (O₂) en oxygène singulet (1O₂). Les molécules d'oxygène singulet ont une durée de vie réduite (demi-vie de 4 microsecondes) et peuvent diffuser sur une distance d'environ 200 nanomètres dans la solution avant de retomber à l'état fondamental.

En l'absence de billes acceptrices, les molécules d'oxygène singulet retombent à l'état fondamental sans produire de signal lumineux. Si une bille acceptrice se trouve à moins de 200 nm, l'énergie est transférée des oxygènes singulets à la bille, ce qui provoque la production de lumière. Les billes acceptrices AlphaScreen contiennent trois colorants chimiques : le thioxène, l'anthracène et le rubrène. Les molécules d'oxygène singulet réagissent d'abord avec le thioxène pour produire de la lumière. Cette lumière est ensuite transférée à l'anthracène et au rubrène, ce qui entraîne une émission de lumière importante entre 520 et 620 nm.²La demi-vie de la réaction de décroissance du signal est de 0,3 seconde.

Dans les essais de liaison, un partenaire de liaison (par exemple un récepteur) est lié au donneur, tandis que l'autre (par exemple un ligand) est lié aux billes acceptrices. Lorsque le récepteur et le ligand interagissent, l'énergie chimique est transférée d'un type de bille à l'autre, ce qui produit un signal lumineux (voir la figure 1). AlphaScreen peut également être utilisé pour des essais de compétition ou de clivage. Dans ces cas, une réduction de l'intensité du signal est mesurée.

Les billes donneuses sont généralement disponibles sous forme de conjugués de streptavidine, qui exploitent la liaison spécifique de la biotine à cette protéine pour marquer les biomolécules. En revanche, les billes acceptrices sont principalement conjuguées à des anticorps. Le second partenaire de liaison nécessite donc généralement la présence d'un antigène correspondant pour se lier (voir la figure 2). Il est également possible de recouvrir directement les deux types de billes avec les partenaires de liaison par amination réductrice.

Comme les deux types de billes ont un diamètre d'environ 250 nm, elles sont trop petites pour sédimenter dans les tampons biologiques. En outre, elles n'obstruent pas les pointes ou les injecteurs et peuvent être facilement gérées par des équipements automatisés de manipulation des liquides. Cependant, ils sont suffisamment grands pour être filtrés ou centrifugés. Le revêtement d'hydrogel permet la conjugaison des biomolécules aux billes tout en réduisant la liaison non spécifique et l'auto-agrégation.

AlphaLISA

AlphaLISA est une technologie ultérieure à AlphaScreen, qui utilise les mêmes billes donneuses, mais des billes acceptrices différentes. Dans les billes AlphaLISA, l'anthracène et le rubrène sont remplacés par des chélates d'europium. L'europium excité émet de la lumière à 615 nm, avec une bande passante beaucoup plus étroite que celle d'AlphaScreen (voir la figure 3). L'émission AlphaLISA est donc moins sensible aux interférences des composés et peut être utilisée pour détecter des analytes dans des échantillons biologiques tels que les surnageants de culture cellulaire, les lysats cellulaires, le sérum et le plasma.

AlphaLISA permet de quantifier les protéines sécrétées, intracellulaires ou de la membrane cellulaire. Il est principalement utilisé comme essai immunologique en sandwich pour la détection de biomarqueurs. Un premier anticorps anti-analyte biotinylé se lie à une bille donneuse de streptavidine, tandis qu'un second anticorps anti-analyte est conjugué à des billes acceptrices d'AlphaLISA. En présence de l'analyte, les billes se rapprochent les unes des autres. L'excitation de la bille donneuse libère des molécules d'oxygène singulet qui transfèrent de l'énergie aux billes acceptrices, ce qui provoque une émission de lumière à 615 nm (voir la figure 4). Il est également possible d'adapter les immunodosages de compétition.

Par rapport aux tests ELISA classiques, AlphaLISA offre une meilleure sensibilité, une gamme dynamique plus large et des performances robustes, avec des temps d'essai réduits. De plus, comme il ne nécessite pas d'étapes de lavage, il peut facilement être adapté au criblage automatisé à haut débit.

AlphaPLEX

AlphaPlex est un nouveau développement qui permet de quantifier jusqu'à trois analytes dans un seul puits, en utilisant des billes acceptrices émettant à des longueurs d'onde distinctes. Dans ces billes, l'anthracène et le rubrène sont remplacés par des chélates de terbium pour l'AlphaPlex 545 et de samarium pour l'AlphaPlex 645. Les anticorps anti-analyte biotinylés se lient aux billes donneuses de streptavidine. En présence des analytes cibles, l'excitation des billes donneuses et la libération d'oxygène singulet qui en résulte déclenchent l'émission de lumière chimiluminescente par les différentes billes acceptrices.

Chaque type de bille émet de la lumière à une longueur d'onde différente. Outre 615 nm pour les billes AlphaLISA, les autres pics d'émission se situent à 545 nm pour les billes de terbium et à 645 nm pour les billes de samarium (voir la figure 5). Il est donc possible de développer des tests triplex en utilisant les billes acceptrices AlphaLISA, AlphaPlex 545 et AlphaPlex 645 dans un seul test.²

Comment détecter l'AlphaScreen ?

La mesure de la chimie AlphaScreen est principalement effectuée sur des lecteurs de microplaques. Comme il s'agit d'un mode de lecture indépendant, la détection de l'essai nécessite un lecteur de microplaques doté de cette fonctionnalité. Comme cette technologie est souvent utilisée pour le criblage de médicaments à haut débit, les lecteurs de microplaques doivent être compatibles avec les plaques de 384 et 1 536 puits.

La configuration de base d'un lecteur de plaques AlphaScreen comprend une source lumineuse, des filtres d'excitation et d'émission permettant de sélectionner la longueur d'onde, ainsi qu'un détecteur à tube photomultiplicateur (PMT).

Source lumineuse : lampe au xénon ou laser

Comme le photosensibilisateur des billes donneuses est spécifiquement excité à 680 nm, une lampe flash au xénon ou un laser d'excitation spécifique sont utilisés comme source lumineuse. Un laser AlphaScreen dédié concentre davantage d'énergie à 680 nm, surpassant les lampes au xénon et permettant d'obtenir de meilleurs résultats, avec une gamme dynamique plus large et des rapports signal-bruit plus élevés.

Les lasers d'excitation AlphaScreen dédiés sont généralement disponibles sur les lecteurs de microplaques multimodes haut de gamme dédiés à la HTS, comme le PHERAstar FSX et le CLARIOstar Plus. Les lecteurs bon marché sont généralement équipés d'une lampe flash au xénon pour la détection de l'AlphaScreen.

AlphaPLEX implique la détection de différentes longueurs d'onde d'émission. Bien que ces longueurs d'onde puissent être mesurées de manière séquentielle, la détection simultanée de deux émissions garantit la qualité des données et présente des avantages en termes de rapidité, en particulier pour les essais de criblage. En conséquence, la détection simultanée de deux émissions permet d'augmenter le débit des tests AlphaLISA-AlphaPlex à double émission.

Réduction de la diaphonie

La diaphonie correspond à la lumière provenant d'un puits autre que celui mesuré, qui est détectée de manière non spécifique et affecte négativement le signal du puits mesuré.

Comme la lumière produite dans un puits par une réaction AlphaScreen est diffuse, elle peut se propager aux puits voisins, voire directement au site de détection, même si un autre puits est mesuré. Cela conduit à des signaux biaisés, à des variations de signal plus importantes et à une sensibilité globale plus faible.

Les signaux lumineux indésirables atteignent le détecteur par le haut de la plaque et/ou à travers la paroi des puits, et doivent être traités différemment (voir la figure 6).

Blocage physique : Le blocage physique est assuré par des ouvertures en forme de cuillère noires et percées. Lorsqu'ils sont positionnés sur un puits spécifique, ils bloquent la lumière indésirable provenant des puits voisins (voir la figure 6). La lumière du puits concerné atteint le détecteur à travers le trou, tandis que la lumière provenant des puits voisins est bloquée physiquement.

Réduction de la diaphonie mathématique : la lumière peut traverser la paroi en plastique d'un puits, même dans les microplaques blanches opaques. Les plaques à haute densité (par exemple, 1 536 puits) sont plus sensibles aux fuites de lumière en raison de la proximité des puits et de leurs parois plus minces. De plus, la diaphonie à travers la paroi est plus importante entre les puits carrés adjacents qu'entre les puits ronds, en raison des parois partagées. La couleur de la plaque influence également la diaphonie à travers les parois de la microplaque : plus la plaque est foncée, plus la diaphonie est faible. Si la plaque ne peut pas être optimisée davantage, une réduction mathématique de la diaphonie peut être appliquée aux données acquises. Pour ce faire, la fuite du signal vers les puits voisins est d'abord déterminée, puis un algorithme corrige les données luminescentes.

Ces deux outils de réduction de la diaphonie sont disponibles sur les lecteurs de plaques PHERAstar FSX et CLARIOstar Plus de BMG LABTECH.

Lecteurs de plaques AlphaScreen

La détection AlphaScreen/AlphaLISA peut être réalisée sur les lecteurs de plaques PHERAstar FSX et CLARIOstar Plus. Étant donné qu'une source d'excitation à haute intensité est bénéfique pour l'essai, ces lecteurs sont équipés de lasers à l'état solide dédiés produisant une lumière à haute intensité à 680 nm. Le PHERAstar FSX offre également des modules optiques AlphaPlex spécifiques permettant de mesurer simultanément deux signaux Alpha.

Avantages de la technologie AlphaScreen

AlphaScreen offre une plateforme homogène, sensible et évolutive, particulièrement adaptée aux applications de criblage à haut débit.

Le rapport signal/bruit de fond est élevé.

Le processus de génération du signal est une réaction en cascade qui produit une forte amplification. Il en résulte une sensibilité élevée. En outre, le bruit de fond est faible. Ceci est principalement dû au fait que la longueur d'onde d'excitation se situe dans la gamme des rouges, à une longueur d'onde supérieure à celle du signal d'émission. Cela réduit l'auto-fluorescence générée par les composants biomoléculaires, généralement excités dans la gamme bleu-vert. De plus, le délai entre l'excitation et l'émission élimine encore davantage le bruit de l'auto-fluorescence.

Essai homogène

La chimie AlphaScreen est homogène : la détection du complexe donneur-accepteur lié ne nécessite pas de séparer physiquement les composants non liés afin de réduire le bruit de fond. Elle ne nécessite donc pas d'étapes de séparation ou de lavage intermédiaires et peut être exécutée selon un protocole simple « add-and-read » (ajouter et lire). Les étapes de manipulation sont ainsi réduites au minimum, ce qui la rend plus pratique et moins longue que d'autres méthodes. Elle est donc particulièrement adaptée au criblage automatisé. C'est l'une des raisons pour lesquelles elle est largement utilisée dans la découverte de médicaments et dans les HTS.

Réduction d'échelle et miniaturisation

En raison de sa haute sensibilité et de son faible bruit de fond, AlphaScreen peut facilement être adapté aux plaques à 1 536 puits et être réduit à quelques µl sans modifier la concentration des réactifs ou la robustesse du test, comme le montre la note d'application « Miniaturisation d'un test TNF-α AlphaLISA à base de cellules ».

Pièges dans la détection de la technologie AlphaScreen

Microplaque et manipulation appropriées

Microplaques et manipulation appropriées
Les microplaques blanches sont les mieux adaptées aux mesures AlphaScreen, car elles réfléchissent le signal lumineux. Les plaques noires, en revanche, absorbent la lumière, ce qui entraîne une réduction du signal et du bruit de fond. Les plaques grises constituent le meilleur compromis entre la réduction de la diaphonie et la réflexion du signal. Vous trouverez des informations détaillées sur le choix des plaques dans notre article de blog « La microplaque : l'utilité en pratique ».

La technique AlphaScreen est sensible à la lumière. Idéalement, elle devrait être préparée et exécutée dans une pièce sombre (moins de 100 lux). Comme cela n'est pas toujours possible, il est recommandé d'équiper une pièce fermée d'un éclairage à filtre vert. Les appareils d'éclairage situés à proximité immédiate de l'espace de travail et/ou du lecteur de plaques doivent être recouverts de ces filtres. L'utilisation de filtres verts s'est avérée presque aussi efficace que l'exécution de l'essai dans l'obscurité (voir la figure 7).

Éclairage de l'environnement

La chimie AlphaScreen est sensible à la lumière. Idéalement, elle devrait être préparée et exécutée dans des conditions de lumière tamisée (moins de 100 Lux). Comme cela n'est pas toujours possible, une pièce fermée doit être équipée d'un éclairage à filtre vert. Les appareils d'éclairage situés à proximité immédiate de l'espace de travail et/ou du lecteur de plaques doivent être recouverts de filtres verts. L'utilisation de filtres verts s'est avérée presque aussi efficace que l'exécution de l'essai dans l'obscurité (fig. 7).

Les plaques destinées à être incubées pendant de longues périodes doivent être protégées de la lumière : recouvrez-les d'un tissu sombre, d'une feuille d'aluminium ou d'une boîte en carton. Évitez également d'exposer la microplaque ou le lecteur de plaques à la lumière du soleil ou à une lumière intense.

Température de l'environnement

La chimie AlphaScreen est sensible à la température. Il convient donc d'éviter les variations importantes de la température ambiante, car celles-ci affectent négativement la génération, l'intensité et la stabilité du signal. En règle générale, la variation du signal AlphaScreen est d'environ 8 % par °C.³

Pour éviter les gradients d'intensité du signal à travers la plaque pendant la lecture, il est également nécessaire d'équilibrer la température des réactifs et des microplaques avec celle de l'environnement. Pour les plaques, il est facile d'y parvenir en les incubant dans un incubateur THERMOstar. Le PHERAstar FSX avec système AAS permet même de régler activement le lecteur sur une température comprise entre 18 et 45°C et de refroidir ainsi la chambre d'incubation de l'appareil à la température ambiante ou à une température inférieure. Cette note d'application démontre la capacité du système AAS à maintenir une température stable, à réduire l'évaporation et le temps de refroidissement entre les températures élevées et basses.

Milieux de culture cellulaire et sérums

Les milieux de culture cellulaire, tels que le RPMI 1640, le MEM et le DMEM, ont un effet négatif sur l'intensité du signal. La présence d'un milieu de culture à 10 % entraîne une extinction du signal d'environ 30 %. De même, l'ajout de 10 % de sérum de veau fœtal réduit le signal d'environ 25 %. Il est donc recommandé de rincer les échantillons de cellules avec un tampon approprié, comme le PBS, avant d'appliquer la chimie AlphaScreen.

Essais AlphaScreen

La technologie AlphaScreen permet d'analyser des événements biochimiques ou de liaison dans des formats de plaques de 96, 384 ou 1 536 puits, dans différents contextes biologiques. Cette technologie est particulièrement répandue dans le domaine du criblage de médicaments.

AlphaScreen est utilisé dans différents essais comme les essais fonctionnels GPCR(cAMP, IP3, et phospho-ERK1/2), les tests enzymatiques(tyrosine kinase, hélicase, protéase, phosphatase), les tests d'interaction (tests de liaison aux cytokines, tests fonctionnels des récepteurs nucléaires, tests de liaison ligand-récepteur, protéine/protéine, protéine/ADN,protéine/peptide), ainsi que les immunodosages de type ELISA pour la quantification d'analytes(TNF-α,IgG).

Essai de liaison : interaction protéine-peptide et identification d'inhibiteurs

Dans la note d'application PHERAstar measures AlphaScreen assay to develop selective inhibitors for the human YEATS domains, nous présentons un exemple d'essai d'interaction basé sur AlphaScreen.

Les domaines YEATS sont des régulateurs épigénétiques. L'ENL contenant des YEATS a été confirmé comme un moteur majeur de plusieurs types de leucémie aiguë. L'ENL est donc une cible privilégiée pour la découverte de médicaments. Pour cribler des inhibiteurs sélectifs, nous avons mis en place un essai de liaison entre l'histone 3 (H3) et le domaine YEATS à l'aide du kit de détection d'histidine AlphaScreen. La bille donneuse est couplée à l'histone 3 acylée via la streptavidine, et la bille acceptrice au domaine YEATS. Lorsque la protéine et le peptide interagissent, les différentes billes se réunissent et un signal AlphaScreen est généré (voir la figure 8). Les inhibiteurs réduisent le signal d'émission en perturbant l'interaction H3-YEATS.

Immunodosage : détection de phospho-ERK1/2

Outre l'interaction, des immunodosages peuvent également être mis en œuvre. Les réponses de nombreux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) ne peuvent pas facilement être mesurées dans les formats d'essai actuels. La cascade de phosphorylation des protéines ERK entraîne la phosphorylation de protéines cytoplasmiques et nucléaires qui régulent la transcription des gènes. Elle peut donc être utilisée pour cribler les changements cellulaires induits par l'activation des RCPG.

À cette fin, le test de phosphorylation des protéines ERK1/2 AlphaScreen SureFire® a été utilisé sur des lysats cellulaires. Il s'agit d'un test immunologique en sandwich. Une protéine cellulaire phosphorylée est prise en sandwich entre un anticorps anti-analyte associé à une bille donneuse recouverte de streptavidine et un anticorps anti-phospho associé à une bille acceptrice conjuguée à la protéine A (voir la figure 9). La phosphorylation de l'analyte entraîne une augmentation du signal lumineux. Ceci est illustré dans la note d'application "An AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2 assay".

Références

Essai immunologique de canalisation de l'oxygène en luminescence : Mesure de la cinétique de liaison des particules par chimiluminescence. Ullman, EF, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, pp. 5426-5430, juin 1994.
Yasgar A, Jadhav A, Simeonov A, Coussens NP. AlphaScreen-Based Assays : Ultra-High-Throughput Screening for Small-Molecule Inhibitors of Challenging Enzymes and Protein-Protein Interactions. Methods Mol Biol. 2016;1439:77-98. doi:10.1007/978-1-4939-3673-1_5
https://www.urmc.rochester.edu/MediaLibraries/URMCMedia/hts/documents/AlphaScreenPracticalGuide.pdf

AlphaScreen, AlphaLISA, AlphaPlex et ^SureFire® sont des marques déposées de PerkinElmer.

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