Polarisation de la fluorescence

Théorie de la détection de la polarisation de la fluorescence

La détection de la polarisation de la fluorescence est basée sur la théorie générale de la détection de la fluorescence à l'état stable que vous pouvez trouver sur la page de l'intensité de la fluorescence. En outre, sa détection repose sur le fait que le degré de polarisation d'un fluorophore est inversement lié à sa vitesse de culbutage et sur l'observation que la lumière émise par un fluorophore peut avoir des intensités différentes sur différents plans de polarisation, généralement perpendiculaires et parallèles au plan d'excitation.

Lorsqu'une lumière polarisée dans le plan excite une petite molécule fluorescente (typiquement <1,5 kDa) non liée (le traceur), celle-ci émet principalement une lumière non polarisée. Ceci est dû au fait qu'une petite molécule libre tourne rapidement dans la solution pendant le temps entre l'excitation et l'émission, et émet donc de la lumière sur différents plans de polarisation (non polarisée).

Inversement, si la petite molécule fluorescente est liée à une plus grande (typiquement >10 kDa), son volume moléculaire accru ralentit sa rotation et entraîne l'émission d'une lumière principalement polarisée dans le même plan que la source d'excitation (fig. 2).

Quantification de la polarisation de la fluorescence

La polarisation de la fluorescence est donc la mesure de la quantité de rotation moléculaire qui a lieu dans le temps entre l'excitation et l'émission du traceur. Elle est calculée par l'équation suivante :

P = (F|| - F⊥)/(F|| + F⊥).

Quantitativement, elle est définie comme la différence entre l'intensité d'émission de fluorescence parallèle (F||) et perpendiculaire (F⊥) au plan de la lumière d'excitation, divisée par l'intensité totale d'émission de fluorescence.¹

La valeur P est un nombre sans dimension, puisqu'il s'agit d'un rapport d'intensités lumineuses. Elle est souvent exprimée en millipolarisation (mP), où 1 P = 1000 mP. Bien que P ait des valeurs allant de -330 à 500 mP, il s'agit de limites théoriques rarement atteintes. Dans les applications bioanalytiques, les données typiques se situent entre 10 et 300 mP (par exemple, fig. 3).

Polarisation de la fluorescence et anisotropie

Le terme anisotropie a été introduit en 1960 et est fréquemment utilisé dans le contexte de l'émission polarisée. L'anisotropie (désignée par A ou r) est le rapport des intensités d'émission dans l'équation ci-dessous :

r = (F|| - F⊥)/(F|| + 2 F⊥)

F|| indique l'intensité après une excitation polarisée verticalement et une polarisation verticale sur la lumière d'émission. F⊥ indique l'intensité lorsque l'on utilise un polariseur vertical sur l'excitation et un polariseur horizontal sur l'émission. ²

La polarisation et l'anisotropie de la fluorescence sont mathématiquement liées et utilisées de manière interchangeable. Elles sont toutes deux dérivées des intensités d'émission de la lumière polarisée et non polarisée et représentent une moyenne des états liés et non liés d'une molécule fluorescente. Pour la plupart des applications, le contenu informatif de leurs fonctions est identique, car l'anisotropie n'apporte aucune information supplémentaire.³

En général, le choix d'un terme ou de l'autre dépend de considérations pratiques et de l'habitude. La polarisation de la fluorescence est le plus souvent utilisée pour décrire l'ensemble de la technologie et en chimie clinique, tandis que l'anisotropie est plus courante en biophysique et enbiochimie.

Comment la polarisation de fluorescence est-elle détectée ?

La polarisation de la fluorescence peut être détectée sur un lecteur de microplaques et repose sur la même procédure et la même installation que l'intensité de la fluorescence. Il existe cependant quelques différences, principalement liées à la sélection des plans de polarisation.

L'échantillon est excité à une longueur d'onde spécifique par une lumière polarisée verticalement (parallèle). La source de lumière d'excitation est généralement une lampe au xénon ou une lampe halogène. Sa lumière blanche est filtrée spectralement à l'aide d'un filtre ou d'un monochromateur. Le plan de polarisation est sélectionné par un filtre spécifique appelé polariseur.

Le vecteur champ électrique de la lumière naturelle peut prendre n'importe quelle direction d'oscillation par rapport à la direction de propagation. Les polariseurs sont des éléments optiques, généralement des films minces, qui peuvent isoler une direction du vecteur électrique. Le polariseur d'excitation est placé entre la source d'excitation et l'échantillon. L'orientation relative du plan vertical transmet la lumière parallèle à l'échantillon et bloque la lumière polarisée perpendiculaire.

La lumière émise par un échantillon est filtrée spectralement par un filtre ou un monochromateur afin d'éliminer les longueurs d'onde indésirables. En outre, la lumière émise doit être séparée en ondes parallèles ou perpendiculaires en fonction de son orientation par rapport au plan de la lumière d'excitation polarisée. Cela est possible grâce à des polariseurs d'émission placés sur le trajet de la lumière entre l'échantillon et le détecteur, qui sont généralement du même type que le polariseur d'excitation. Enfin, l'intensité des deux plans polarisés est quantifiée par un détecteur, généralement un tube photomultiplicateur (PMT).

Les deux plans sont détectés séparément. L'approche la plus simple consiste à détecter les plans parallèles et perpendiculaires par deux mesures séquentielles. Après avoir détecté l'intensité de la polarisation parallèle lors de la première mesure, le polariseur d'émission tourné de 90° est utilisé pour détecter le plan horizontal (perpendiculaire) (fig. 4).

Leslecteurs de plaques de polarisation de fluorescence haut de gamme comme lePHERAstarFSX peuventacquérir les deux plans de polarisation simultanément, grâce à latechnologie de détection Simultaneous Dual Emission. Cette approche permet de gagner du temps et de réduire la variabilité générée par deux mesures séquentielles.

Considérations sur la détection de la polarisation de la fluorescence

En général, les monochromateurs ne sont pas recommandés pour la détection de la polarisation de fluorescence en raison de leur faible transmission intrinsèque de la lumière et de l'importance du bruit de fond (lumière parasite). Ces facteurs concourent à augmenter la variabilité des échantillons, ce qui affecte négativement la fenêtre et la robustesse de l'essai.

Pour la détection dans la gamme UV, les lecteurs doivent être équipés d'une lampe au xénon. Les lampes halogènes ne sont pas recommandées en raison de leur faible émission en dessous de 400 nm. En outre, des polariseurs UV spécifiques sont nécessaires, car les polariseurs ordinaires ont une faible transmission dans les longueurs d'onde UV.

De faibles niveaux de polarisation (P) indiquent que les molécules fluorescentes ne se sont pas liées et se déplacent librement dans la solution. Des niveaux élevés de P indiquent la présence d'un complexe moléculaire plus important. Bien que la plage de mesure dans les applications bioanalytiques de 10 à 300 mP puisse sembler assez restreinte, des mesures très précises avec des écarts types de ± 0,5 mP peuvent être réalisées avec des lecteurs de microplaques multimodes haut de gamme tels que le PHERAstar FSX ou leCLARIOstarPlus.

Fluorophores pour les essais de polarisation par fluorescence

Le choix d'un colorant fluorescent pour les essais de polarisation par fluorescence est d'une importance capitale. Leurs spectres d'excitation et d'émission doivent différer des longueurs d'onde des autres molécules présentes dans la solution afin de réduire l'autofluorescence et ils doivent avoir un grand décalage de Stokes pour réduire l'influence négative de la diffusion de la lumière. Les fluorophores doivent être facilement conjugués au traceur, sans perturber sa rotation ni interférer avec l'interaction. En outre, ils doivent avoir un rendement quantique élevé (c'est-à-dire une forte intensité) et être chimiquement stables et photostables^.4

Les fluorophores les plus couramment utilisés sont l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et les colorants ayant des spectres similaires. Récemment, cependant, grâce à l'amélioration des performances des lecteurs de microplaques modernes, les colorants rouges tels que Cy3B et Cy5 ont gagné en popularité. Étant donné que leur faible rendement photonique intrinsèque ne représente plus une limitation en raison des améliorations techniques apportées à la détection du signal, leur utilisation peut être avantageuse pour réduire les faux négatifs liés à l'autofluorescence qui émettent généralement dans la gamme des verts et des bleus, ainsi que les faux positifs causés par des événements de diffusion de la lumière.⁵

Avantages de la polarisation de la fluorescence

Parmi les approches utilisées pour étudier les événements de liaison moléculaire, la polarisation de fluorescence est unique. Comme elle est basée sur une stratégie de marquage fluorescent unique, des étapes de séparation supplémentaires ne sont pas nécessaires. Par conséquent, il est possible d'utiliser moins de réactifs, généralement moins coûteux, par rapport aux méthodes conventionnelles. En outre, l'intégrité de l'échantillon n'étant pas affectée, les échantillons peuvent souvent être mesurés de manière répétitive, à condition que le pH, la température et la viscosité soient constants.

La PF permet de contrôler directement le rapport libre/lié d'un traceur en solution en temps réel, ce qui permet une analyse d'équilibre avec des concentrations très faibles (généralement de l'ordre du picomolaire). Cependant, en raison de sa nature en temps réel, les expériences ne sont pas limitées à l'équilibre et la cinétique d'association/dissociation peut être facilement analysée.

La PF est une technique homogène avec un protocole simple de mélange et de lecture qui ne nécessite pas la séparation des espèces liées et libres à mesurer. Les essais homogènes permettent une quantification plus précise des événements de liaison, car la réaction de liaison n'est pas perturbée par des étapes supplémentaires. Cependant, il est important de noter que d'autres tests homogènes, tels que FRET,TR-FRET ou^{AlphaScreen®}, nécessitent d'autres réactions de marquage en plus du marquage unique du traceur.

En outre, la nature ratiométrique de la PF élimine l'influence négative que l'absorbance ou la trempe du composé peut avoir sur l'acquisition des données et permet la miniaturisation. Toutes ces raisons ont conduit à l'adoption des tests FP dans lecriblage à haut débit.

Limites de la polarisation de fluorescence

Malgré tous ses avantages, ce système de mesure présente certaines limites. La polarisation de fluorescence nécessite d'importantes modifications du volume moléculaire pour générer un signal maximal et une fenêtre d'essai. Au mieux, un essai de liaison par polarisation de fluorescence peut surveiller l'interaction entre une petite et une grande molécule et nécessite le marquage du plus petit partenaire d'interaction avec un fluorophore. Par conséquent, les traceurs sont généralement de petites protéines ou peptides, des cytokines et des composés chimiques. Cela garantit généralement la plus grande différence possible de volume moléculaire lors de la liaison et donc la plus grande fenêtre d'essai possible. L'essai de liaison FP n'est pas adapté à l'observation de l'interaction de deux grandes protéines.

En outre, l'autofluorescence des composés et la diffusion de la lumière peuvent provoquer des artefacts. Par conséquent, il est généralement recommandé de quantifier le fond de fluorescence d'un puits avant l'ajout du colorant fluorescent et de le soustraire du calcul. L'autofluorescence étant généralement moins prononcée à des longueurs d'onde élevées, l'adoption de colorants rouges tels que BODIPY TMR ou Cy5 peut être utilisée pour minimiser le bruit de fond.^{6, 7}

Applications : essai de liaison par polarisation de fluorescence

L'essai de liaison par polarisation de fluorescence peut être utilisé pour analyser les événements d'interaction ou de dissociation moléculaire dans les interactionsprotéine-ligand oupeptide-protéine, lesinteractions protéine-ADN, ainsi que l'agrégation des protéines préfibrillaires. En outre, il peut également être utilisé pour identifier les composés interférents et les inhibiteurs non spécifiques.

D'autres applications comprennent l'analyse de lafluidité membranaire dans les liposomes et les membranes mitochondriales, ainsi que des essais enzymatiques tels que la protéolyse, lasynthèse de l'ARN, la cinétique de liaison et laconjugaison/déconjugaison de l'ubiquitineen temps réel(fig. 5). Les applications en temps réel pour l'ubiquitine peuvent être utilisées par exemple dans la dégradation ciblée des protéines pour les PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) ou les colles moléculaires, y compris les études de leur activité de liaison à leurs cibles et la cinétique des interactions. Les tests de liaison FP peuvent également être utilisés pour étudier la dégradation ciblée des protéines résultant d'interactions spécifiques entre des dégrons et des ligases connus.

Essais de polarisation de fluorescence dans le criblage de petites molécules

Dans les années 90, la polarisation de fluorescence a été adoptée dans l'environnement du criblage de médicaments pour faciliter le processus de découverte de médicaments. Aujourd'hui, elle est couramment utilisée dans les installations de criblage, en raison de son format homogène, rapide et quantitatif. Comme la PF est souvent linéairement proportionnelle au pourcentage de traceur lié/libre, elle est fréquemment utilisée pour déterminer les valeurs_IC50 des médicaments candidats.

Dans le cadre de la découverte de médicaments, elle a été utilisée pour étudier différentes cibles telles que les RCPG, les kinases, les phosphatases et les protéases. Alors que, dans les études d'interaction, la PF détecte généralement une augmentation du volume moléculaire, dans les essais de dissociation et de dégradation enzymatique, la diminution du volume moléculaire est généralement utilisée comme indicateur.

Les principales applications des essais de polarisation de fluorescence dans le domaine des technologies de pointe sont l'analyse des interactions moléculaires directes et des réactions enzymatiques. Ici, des lecteurs de microplaques rapides et sensibles permettent le criblage efficace de petites molécules pour une gamme croissante de classes de cibles. Les exemples incluent lecriblage d'inhibiteurs du régulateur d'ubiquitination et de la cible anticancéreuse CSN5, ainsi que lecriblage d'inhibiteurs de la H-prostaglandine D-synthase.

Polarisation de la fluorescence HomoFRET

Le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) est une méthode courante pour étudier les interactions. En règle générale, les deux partenaires d'interaction supposés sont marqués avec deux fluorophores différents (donneur et accepteur). Cependant, le FRET peut également avoir lieu entre des fluorophores similaires (homoFRET). La PF peut être appliquée à l'homoFRET, car le transfert d'énergie entraîne une randomisation de la polarisation de l'émission, ce qui produit un signal dépolarisé. L'homoFRET-FP peut être utilisé pour étudier l'accumulation de protéines ou les événements de dimérisation dans une cellule, comme décrit dans la note d'application "Monitoring of insulin granule packaging in live cells using homoFRET-FP detection" (fig. 6).

Immunodosage par polarisation de fluorescence

Le dosage immunologique par polarisation de fluorescence (FPIA) a été le premier à être appliqué en biochimie. Il s'agit d'un test biochimique compétitif utilisé pour détecter des antigènes ou des anticorps. Dans un dosage immunologique par polarisation de fluorescence, un antigène lié à un fluorophore est utilisé comme traceur. Ce dernier et un second antigène sont généralement en compétition pour lier un anticorps sélectionné. Une forte liaison entre le traceur et l'anticorps entraîne généralement un signal polarisé, tandis que si l'antigène non marqué est principalement lié à l'anticorps, le traceur libre produira une lumière non polarisée. Ce changement est proportionnel à la quantité d'antigène présente dans l'échantillon^.8

Références

1. Lakowicz JR, Principles of fluorescence spectroscopy, troisième édition, 2010.
2. Jablonski A. 1960. On the notion of emission anisotropy. Bull l'Acad Pol Sci, Ser A 8:259-264.
3. Mocz G. Information content of fluorescence polarization and anisotropy. J Fluoresc. 2006 Jul;16(4):511-24.
4. Zhang, H. ; Yang, S. ; De Ruyck, K. ; Beloglazova, N.V. ; Eremin, S.A. ; De Saeger, S. ; Zhang, S. ; Shen, J.;Wang, Z. Fluorescence polarization assays for chemical contaminants in food and environmental analyses. TrAC Trends Anal. Chem. 2019, 114, 293-313.
5. Turek-Etienne TC, Small EC, Soh SC, Xin TA, Gaitonde PV, Barrabee EB, et al : Evaluation of fluorescent compound interference in 4 fluorescence po-larization assays : 2 kinases, 1 protease, and 1 phosphatase. J Biomol Screen. 2003;8:176-184.
6. Owicki JC. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening : perspectives and primer (polarisation et anisotropie de fluorescence dans le criblage à haut débit). J Biomol Screen. 2000;5(5):297-306.
7. Turek-Etienne TC, Lei M, Terracciano JS, et al. Use of red-shifted dyes in a fluorescence polarization AKT kinase assay for detection of biological activity in natural product extracts. J Biomol Screen. 2004;9(1):52-61.
8. Essai immunologique rapide et sensible par polarisation de fluorescence pour la détermination de l'acide mycophénolique libre dans le sérum et le plasma humains. Bettina Glahn-Martínez, Elena Benito-Peña, Francesca Salis, Ana B. Descalzo, Guillermo Orellana, et María C. Moreno-Bondi Analytical Chemistry 2018 90 (8), 5459-5465.